慢性成人牙周炎患者龈沟液谷胱甘肽过氧化物酶的测定
作者：舒婷 黄萍 王晖 张静仪 张平 陈红英
单位：舒婷 黄萍 王晖(华西医科大学口腔医学院 610041)；张静仪 张平 陈红英(卫生部生物医 学工程重点实验室)
关键词：牙周炎；龈沟液；谷胱甘肽过氧化物酶；自由基
实用口腔医学杂志000210 〔摘要〕 目的：证实龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)中谷胱甘肽过 氧化物酶(glutathione peroxida.se,GPx)的存在，初步探讨其与牙周病的关系。[ HT5”H 方法：选择12名牙周健康者(H组)的21个牙位点及23名慢性成人牙周炎 患者(AP组)44个牙位点用DTNB显色法测定GCF-GPx活性，并记录AP组GI、PD、AL。结果：AP组GCF-GPx活性〔(160.07±121.44)U〕明显低于H组(503.35±304. 36)(P<0.001)，AP组GPx活性与PD、AL负相关(r=-0.3058,P<0.05 r=-0.42 92，P<0.05)。结论：GCF-GPx的存在间接提示：牙周炎可能是 局部自由基产生清除失衡的结果，牙周局部存在着抗氧化能力的下降。证实龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)中谷胱甘肽过 氧化物酶(glutathione peroxida.se,GPx)的存在，初步探讨其与牙周病的关系。[ HT5”H 方法：选择12名牙周健康者(H组)的21个牙位点及23名慢性成人牙周炎 患者(AP组)44个牙位点用DTNB显色法测定GCF-GPx活性，并记录AP组GI、PD、AL。结果：AP组GCF-GPx活性〔(160.07±121.44)U〕明显低于H组(503.35±304. 36)(P<0.001)，AP组GPx活性与PD、AL负相关(r=-0.3058,P<0.05 r=-0.42 92，P<0.05)。结论：GCF-GPx的存在间接提示：牙周炎可能是 局部自由基产生清除失衡的结果，牙周局部存在着抗氧化能力的下降。
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中图分类号：R781.4+2 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0115-03
Glutathione peroxidase activty in gingival crevicular fluid of the patients with chronic adult periodontitis
Su Ting,Huang Ping,Wang Hui
(College of Stomtology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
〔Abstract〕Objective:To study the glutathione peroxidase (GPx) activ ity in gingival crevicular fluid(GCF),and its relationship with chronic periodon titis in adults.Methods:GCF-GPx activity of 12 healthy su bjects (H) and 21 chronic adult periodontitis patients (AP) was determined by DT NB method.GI,PD,AL of AP group were recorded.Results:GCF- GPx activity (U) in group AP and group H were 160.07±121.44 and 503.35±304.36 respectively (P<0.001),that in group AP was negatively correlated with PD an d AL.Conclusion.The imbalance between local free radicals pr oduction and clearance might lead to periodontal disease because of the inabilit y of antioxidation to some extend.
, 百拇医药
Key words Peridontitis;Gingival crevicular fluid; Glutathione pe roxidase; Free radicals chronic adult
牙周炎发病因素复杂，现多认为是细菌感染性疾病，牙周致病菌激发的过度的宿主反应 ，尤其是炎症反应，是牙周组织破坏的主要原因〔1〕。与身体其它部位炎症类似 ，局部浸润的炎症细胞在“呼吸爆发”(respiratory burst)过程中将产生大量的氧化产物 〔2〕。自由基(FR)在杀灭微生物的同时，也破坏正常的组织细胞结构。机体内有多 种天然的FR清除剂，正常情况下FR的产生和清除处于动态平衡，一旦平衡关系打破，即可导 致病理状态。FR已被证实为多种疾病的致病因子，如炎症、肿瘤、衰老等。
龈沟液(gingival crevicular fluid，GCF)中已检测出多种宿主反应产物。本研究即首次证 实了GCF中FR清除剂-谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)的存在，比较了慢性 成人牙周炎组与牙周健康组GCF-GPx活性的差异，分析了该酶的活性与牙周临床指标的相关 性，以初步探讨其与牙周炎的关系。
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1 材料和方法
1.1 对象
临床确诊为慢性成人牙周炎(AP)组23人(男13人，女10人)，年龄31～63岁，平均年龄43.8岁 ，皆来自华西医科大学口腔医院牙周病诊室初诊患者，选取44个患牙，记录临床指标，收集 GCF样本。牙周健康组(H)组12人(男7人，女5人)，年龄31～62岁，平均年龄42.8岁，皆为本 院学生或教职工，选取21个受检牙。以上纳入研究者，无全身系统疾患，3月内未使用过抗 生素及其它影响FR的药物，半年内无牙周治疗史，妇女未妊娠。
1.2 方法
1.2.1 GCF样本的采集与处理 隔湿取样牙，去除龈上菌斑，将专用滤纸条(Periopaper)放 大该牙颊侧近中的牙周袋或龈沟内，留置30 s后取出(若滤纸条上有血则弃去，重新选牙)。 10 s后在同一位点再次取样，用龈沟液测量仪(periotron 8000)测得液量后立即将两张滤纸 条一同放入盛有200 μl生理盐水的EP管中(龈沟液的总量为两次之和)，置于-20°冰箱内 保存待用。1月内成批取出，室温下解冻，漩涡振荡器上振荡洗涤，10 000 r/min离心，10 min后取出上清液，测定酶活性。
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1.2.2 记录牙周临床指标 为防止对GCF质和量的影响，临床指标的记录均在取样后进行。记录如下指标：牙龈指数(GI )、探诊深度(PD)、附着丧失(AL)。
1.2.3 GCF-GPx的测定 参照夏奕明等〔3〕的DTNB直接法，在自动微板读数仪上测定GCF-GPx活性。
原理：
GPx活力以催化GSH氧化的反 应速度即单位时间内GSH减少的量来表示。GSH和5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(缩写DTNB )反应，在GPx催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，测定该离子的浓度，即可计 算出GSH减少的量。由于GSH在没有酶的条件下也能进行氧化(非酶反应)，所以最后计算酶的 活性时，必须扣除非酶反应引起的GSH的减少量。
单位定义：每微升GCF在37°反应5 min，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1 μmol为1个酶活 单位(U)。
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1.2.4 试剂和操作步骤(略)
2 结 果
2.1 AP组GCF-GPx活性明显低于H组(P<0.001)(表1)。
表1 H组与CAP组GCF-GPx活性(U) 分组
n
±s
t
P
H
21
503.35±304.36
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6.5144
<0.001
CAP
44
160.07±121.44
2.2 AP患者GCF-Gpx和各项临床指标关系
AP患者GCF-GPx水平与其它各项临床 指标间的直线相关分析表明，GCF-GPx水平与GI无相关关系(r=-0.0662,P>0.05)， 与PD呈弱的负相关系(r=-3058,P<0.05)，与AL的负相关程度相对较高(r=-0.42 92,P<0.005)，说明牙周袋深，附着丧失重者GCF-GPx水平低(表2)。表2 AP患者临床指标与GCF-GPx相关关系 GCF-GPx
临床指标
, 百拇医药
r
P
GI
-0.0662
>0.05
PD
-0.3058
<0.05
AL
-0.4292
<0.005
3 讨 论
近年来，自由基(FR)与牙周病的关系已日益受到重视〔4〕。本研究采用DTNB显色法 在健康及炎症部位GCF中均检测出了FR清除剂--GPx的活性，这间接反映了局部牙周部位的F R的存在及作用。GPx是一种广泛存在于机体组织细胞中线粒体、胞浆内以及生物膜上的水溶 性四聚蛋白酶，能将H2O2还原为H2O，使得O2通过其中间产物H2O2生成活性最 强的膜氧化剂OH的链式反应被打断，从而保护细胞免受FR损害〔5,6〕。本实验结果 显示，AP组GCF-GPx活性降低，与H组相比差异有高度显著(P<0.001)，说明AP组存在抗 氧化能力的下降，进而增加了对牙周病的易感性。GPx活性降低可能有以下几个方面的原因 ：①牙周致病菌激发的防御反应过程中局部FR浓度增高，GPx消耗过多；②FR与蛋白质中肽 腱、氨基酸残基及巯基反应，改变了蛋白质分子的结构性质和酶的活性；③机体缺乏微量元 素Se(GPx酶分子的活性中心)、Vitc、VitE(小分子自由基清除剂，可协同GPx的抗氧化活性) 等，或是其他未明的全身因素导致GPx生物合成减少或活性降低。
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Ramfjord〔7〕于1959年首次用附着水平来反应和衡量牙周组织的破坏程度。本研究 发现GCF-GPx活性与PD，AL等临床指标负相关，说明牙周袋深，附着水平丧失重者GCF-GPx 活性低，即牙周组织破坏越重者，局部抗氧化能力越低。但本研究尚不能明确GCF-GPx活性 降低是否发生在牙周组织破坏之前，以及是否有因果关系，孰因孰果。若想阐明这些问题， 尚需做更深入的研究。作者认为，在牙周炎发展过程中存在一个“恶性循环”，菌斑堆积导 致过度的炎症反应，使局部FR生成增多，GPx大量消耗并被失活，削弱了组织的抗氧化能力 ，于是对牙周炎症的易感性增加，加速组织的破坏，FR进一步生成。打断这个恶性循环如在 菌斑堆积之初即采取措施控制菌斑，和及时补充外源型抗氧化物如Vitc，VitE，β-胡萝卜 素、微量元素等，应能逆转早期的牙周炎症。牙周病是自由基失衡的疾病，机体如能自身调 节平衡，损伤即可避免。
另外，GPx是如何从线粒体、胞浆内及生物膜上进入GCF中的，该机制还不明了。本文做如下 推测∶①FR的产生超过了细胞的清除能力，导致生物膜的损伤，细胞死亡后的非特异性释放 ；②细胞针对局部增多的FR的应激情况，有选择地主动释放GPx。上述推测还需进一步的免 疫组织化学的研究证实。
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参考文献
1，Lamster IB.Evaluation of components of gingivl crevicular fluid as diag nostic test.Ann Periodontol,1997,2:123
2，Babior BM.Oxidants from phagocytes:Agents of defense and destrcution.Blood,198 4,6:959
3，夏亦明,朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究,1987，16(4) ：29
4，黄萍,王晖,张蕴惠.牙周病变组织GPx的测定.实用口腔医学杂志，1998，14(1)：11
5，Charon JA,Mergenhagen SE,Gallin JI.Gingivitis and oral ulceration in patients with neutrophil dysfunction.J Oral Pathol,1985,14:150
6，潘世茂主编.病理生理学进展.北京：人民卫生出版社，1987.67～69
7，Ramfjord SP.Indices for prevalence and incidence of periodontal disease.J Per oidontol,1959,30:51
(收稿：1999-06-18 修回：1999-11-29), 百拇医药
单位：舒婷 黄萍 王晖(华西医科大学口腔医学院 610041)；张静仪 张平 陈红英(卫生部生物医 学工程重点实验室)
关键词：牙周炎；龈沟液；谷胱甘肽过氧化物酶；自由基
实用口腔医学杂志000210 〔摘要〕 目的：证实龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)中谷胱甘肽过 氧化物酶(glutathione peroxida.se,GPx)的存在，初步探讨其与牙周病的关系。[ HT5”H 方法：选择12名牙周健康者(H组)的21个牙位点及23名慢性成人牙周炎 患者(AP组)44个牙位点用DTNB显色法测定GCF-GPx活性，并记录AP组GI、PD、AL。结果：AP组GCF-GPx活性〔(160.07±121.44)U〕明显低于H组(503.35±304. 36)(P<0.001)，AP组GPx活性与PD、AL负相关(r=-0.3058,P<0.05 r=-0.42 92，P<0.05)。结论：GCF-GPx的存在间接提示：牙周炎可能是 局部自由基产生清除失衡的结果，牙周局部存在着抗氧化能力的下降。证实龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)中谷胱甘肽过 氧化物酶(glutathione peroxida.se,GPx)的存在，初步探讨其与牙周病的关系。[ HT5”H 方法：选择12名牙周健康者(H组)的21个牙位点及23名慢性成人牙周炎 患者(AP组)44个牙位点用DTNB显色法测定GCF-GPx活性，并记录AP组GI、PD、AL。结果：AP组GCF-GPx活性〔(160.07±121.44)U〕明显低于H组(503.35±304. 36)(P<0.001)，AP组GPx活性与PD、AL负相关(r=-0.3058,P<0.05 r=-0.42 92，P<0.05)。结论：GCF-GPx的存在间接提示：牙周炎可能是 局部自由基产生清除失衡的结果，牙周局部存在着抗氧化能力的下降。
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中图分类号：R781.4+2 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0115-03
Glutathione peroxidase activty in gingival crevicular fluid of the patients with chronic adult periodontitis
Su Ting,Huang Ping,Wang Hui
(College of Stomtology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
〔Abstract〕Objective:To study the glutathione peroxidase (GPx) activ ity in gingival crevicular fluid(GCF),and its relationship with chronic periodon titis in adults.Methods:GCF-GPx activity of 12 healthy su bjects (H) and 21 chronic adult periodontitis patients (AP) was determined by DT NB method.GI,PD,AL of AP group were recorded.Results:GCF- GPx activity (U) in group AP and group H were 160.07±121.44 and 503.35±304.36 respectively (P<0.001),that in group AP was negatively correlated with PD an d AL.Conclusion.The imbalance between local free radicals pr oduction and clearance might lead to periodontal disease because of the inabilit y of antioxidation to some extend.
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Key words Peridontitis;Gingival crevicular fluid; Glutathione pe roxidase; Free radicals chronic adult
牙周炎发病因素复杂，现多认为是细菌感染性疾病，牙周致病菌激发的过度的宿主反应 ，尤其是炎症反应，是牙周组织破坏的主要原因〔1〕。与身体其它部位炎症类似 ，局部浸润的炎症细胞在“呼吸爆发”(respiratory burst)过程中将产生大量的氧化产物 〔2〕。自由基(FR)在杀灭微生物的同时，也破坏正常的组织细胞结构。机体内有多 种天然的FR清除剂，正常情况下FR的产生和清除处于动态平衡，一旦平衡关系打破，即可导 致病理状态。FR已被证实为多种疾病的致病因子，如炎症、肿瘤、衰老等。
龈沟液(gingival crevicular fluid，GCF)中已检测出多种宿主反应产物。本研究即首次证 实了GCF中FR清除剂-谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)的存在，比较了慢性 成人牙周炎组与牙周健康组GCF-GPx活性的差异，分析了该酶的活性与牙周临床指标的相关 性，以初步探讨其与牙周炎的关系。
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1 材料和方法
1.1 对象
临床确诊为慢性成人牙周炎(AP)组23人(男13人，女10人)，年龄31～63岁，平均年龄43.8岁 ，皆来自华西医科大学口腔医院牙周病诊室初诊患者，选取44个患牙，记录临床指标，收集 GCF样本。牙周健康组(H)组12人(男7人，女5人)，年龄31～62岁，平均年龄42.8岁，皆为本 院学生或教职工，选取21个受检牙。以上纳入研究者，无全身系统疾患，3月内未使用过抗 生素及其它影响FR的药物，半年内无牙周治疗史，妇女未妊娠。
1.2 方法
1.2.1 GCF样本的采集与处理 隔湿取样牙，去除龈上菌斑，将专用滤纸条(Periopaper)放 大该牙颊侧近中的牙周袋或龈沟内，留置30 s后取出(若滤纸条上有血则弃去，重新选牙)。 10 s后在同一位点再次取样，用龈沟液测量仪(periotron 8000)测得液量后立即将两张滤纸 条一同放入盛有200 μl生理盐水的EP管中(龈沟液的总量为两次之和)，置于-20°冰箱内 保存待用。1月内成批取出，室温下解冻，漩涡振荡器上振荡洗涤，10 000 r/min离心，10 min后取出上清液，测定酶活性。
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1.2.2 记录牙周临床指标 为防止对GCF质和量的影响，临床指标的记录均在取样后进行。记录如下指标：牙龈指数(GI )、探诊深度(PD)、附着丧失(AL)。
1.2.3 GCF-GPx的测定 参照夏奕明等〔3〕的DTNB直接法，在自动微板读数仪上测定GCF-GPx活性。
原理：
GPx活力以催化GSH氧化的反 应速度即单位时间内GSH减少的量来表示。GSH和5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(缩写DTNB )反应，在GPx催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，测定该离子的浓度，即可计 算出GSH减少的量。由于GSH在没有酶的条件下也能进行氧化(非酶反应)，所以最后计算酶的 活性时，必须扣除非酶反应引起的GSH的减少量。单位定义：每微升GCF在37°反应5 min，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1 μmol为1个酶活 单位(U)。
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1.2.4 试剂和操作步骤(略)
2 结 果
2.1 AP组GCF-GPx活性明显低于H组(P<0.001)(表1)。
表1 H组与CAP组GCF-GPx活性(U) 分组
n
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21
503.35±304.36
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6.5144
<0.001
CAP
44
160.07±121.44
2.2 AP患者GCF-Gpx和各项临床指标关系
AP患者GCF-GPx水平与其它各项临床 指标间的直线相关分析表明，GCF-GPx水平与GI无相关关系(r=-0.0662,P>0.05)， 与PD呈弱的负相关系(r=-3058,P<0.05)，与AL的负相关程度相对较高(r=-0.42 92,P<0.005)，说明牙周袋深，附着丧失重者GCF-GPx水平低(表2)。表2 AP患者临床指标与GCF-GPx相关关系 GCF-GPx
临床指标
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>0.05
PD
-0.3058
<0.05
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-0.4292
<0.005
3 讨 论
近年来，自由基(FR)与牙周病的关系已日益受到重视〔4〕。本研究采用DTNB显色法 在健康及炎症部位GCF中均检测出了FR清除剂--GPx的活性，这间接反映了局部牙周部位的F R的存在及作用。GPx是一种广泛存在于机体组织细胞中线粒体、胞浆内以及生物膜上的水溶 性四聚蛋白酶，能将H2O2还原为H2O，使得O2通过其中间产物H2O2生成活性最 强的膜氧化剂OH的链式反应被打断，从而保护细胞免受FR损害〔5,6〕。本实验结果 显示，AP组GCF-GPx活性降低，与H组相比差异有高度显著(P<0.001)，说明AP组存在抗 氧化能力的下降，进而增加了对牙周病的易感性。GPx活性降低可能有以下几个方面的原因 ：①牙周致病菌激发的防御反应过程中局部FR浓度增高，GPx消耗过多；②FR与蛋白质中肽 腱、氨基酸残基及巯基反应，改变了蛋白质分子的结构性质和酶的活性；③机体缺乏微量元 素Se(GPx酶分子的活性中心)、Vitc、VitE(小分子自由基清除剂，可协同GPx的抗氧化活性) 等，或是其他未明的全身因素导致GPx生物合成减少或活性降低。
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Ramfjord〔7〕于1959年首次用附着水平来反应和衡量牙周组织的破坏程度。本研究 发现GCF-GPx活性与PD，AL等临床指标负相关，说明牙周袋深，附着水平丧失重者GCF-GPx 活性低，即牙周组织破坏越重者，局部抗氧化能力越低。但本研究尚不能明确GCF-GPx活性 降低是否发生在牙周组织破坏之前，以及是否有因果关系，孰因孰果。若想阐明这些问题， 尚需做更深入的研究。作者认为，在牙周炎发展过程中存在一个“恶性循环”，菌斑堆积导 致过度的炎症反应，使局部FR生成增多，GPx大量消耗并被失活，削弱了组织的抗氧化能力 ，于是对牙周炎症的易感性增加，加速组织的破坏，FR进一步生成。打断这个恶性循环如在 菌斑堆积之初即采取措施控制菌斑，和及时补充外源型抗氧化物如Vitc，VitE，β-胡萝卜 素、微量元素等，应能逆转早期的牙周炎症。牙周病是自由基失衡的疾病，机体如能自身调 节平衡，损伤即可避免。
另外，GPx是如何从线粒体、胞浆内及生物膜上进入GCF中的，该机制还不明了。本文做如下 推测∶①FR的产生超过了细胞的清除能力，导致生物膜的损伤，细胞死亡后的非特异性释放 ；②细胞针对局部增多的FR的应激情况，有选择地主动释放GPx。上述推测还需进一步的免 疫组织化学的研究证实。
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参考文献
1，Lamster IB.Evaluation of components of gingivl crevicular fluid as diag nostic test.Ann Periodontol,1997,2:123
2，Babior BM.Oxidants from phagocytes:Agents of defense and destrcution.Blood,198 4,6:959
3，夏亦明,朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究,1987，16(4) ：29
4，黄萍,王晖,张蕴惠.牙周病变组织GPx的测定.实用口腔医学杂志，1998，14(1)：11
5，Charon JA,Mergenhagen SE,Gallin JI.Gingivitis and oral ulceration in patients with neutrophil dysfunction.J Oral Pathol,1985,14:150
6，潘世茂主编.病理生理学进展.北京：人民卫生出版社，1987.67～69
7，Ramfjord SP.Indices for prevalence and incidence of periodontal disease.J Per oidontol,1959,30:51
(收稿：1999-06-18 修回：1999-11-29), 百拇医药