产黑普氏菌内毒素脂多糖的免疫生物学活性研究
作者：荫俊 张松乐 侯晓军 陈跃峰 王忠泽 张郁 孙叶方
单位：荫俊 张松年 侯晓军 陈跃峰 王忠泽(100071 北京，军事医学科学院微生物流行病研究所)；张郁 孙叶方(第四军医大学牙髓生物学实验室)
关键词：拟杆菌；产黑素；细胞因子；内毒素类
中华微生物学和免疫学杂志990202 【 摘要 】 目的 在体外细胞培养系统和小鼠模型中检测产黑普氏菌ATCC25845内毒素脂多糖对内源性细胞因子的介导活性。 方法 采用Kramer测定法、软琼脂细胞培养法和胸腺细胞增殖法测定内毒素脂多糖对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)、白细胞介素1(interleukin1,IL-1)的诱导活性以及局部皮肤斯氏反应(SPD50)。结果 产黑普氏菌ATCC25845内毒素可显著地诱导TNF、CSF和IL-1的产生，在一定剂量范围内呈剂量依赖型。并可导致家兔典型的皮肤局部斯氏反应。 结论 产黑普氏菌ATCC25845内毒素脂多糖在动物模型中具有显著的炎症性细胞因子诱导活性。
, 百拇医药
Production of cytokines induced by endotoxin prepared from Prevotella melaninogenica YIN Jun, ZHANG Songle, HOU Xiaojun, et al. Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071
【 Abstract 】 Objective To explore the cyto-immunological effect of endotoxin prepared from P. melaninogenicus (P.m) ATCC25845 on the production of interlukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor (TNF), colony stimulating factor (CSF) and Shwartzman preparatory Dose50 (SPD50) both in cell cultures and mice. Methods Kramer's method, soft agar cell culture and thymocyte proliferation were applied for testing the effects . Results The results demonstrated that IL-1 could be produced at dose 1.0ng of endotoxin. And the levels of IL-1 were correlated with the doses of endotoxin. The endotoxin could also induce production of sera TNF at a dose of 1.0μg in mice. TNF could be found in sera of mice after endotoxin injection one hour later and disappeared within six hours. The results still revealed that the endotoxin of P. m had an inducing activity on macrophages of mice in production CSF at a dose 0.1μg and was dose dependent. The SPD50 of P.m endotoxin was 64μg in local Shwartzman reaction. Conclusion These results demonstrate that the inducing activities of P.m endotoxin on cytokines may be important for its pathogenesis in clinical infection.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Prevotella melaninogenica Cytokines Endotoxin
产黑普氏菌(Prevotella melaninogenica,P.m)为革兰氏阴性专性厌氧菌。广泛存在于口腔、消化道、呼吸道和泌尿生殖道，是临床厌氧菌感染的重要致病菌〔1，2〕。由于专性厌氧培养条件的限制，对其致病机理的研究较少。内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为一种强免疫原，可启动机体多种免疫反应。研究产黑普氏菌内毒素的免疫生物学活性，有助于了解其致病作用的分子基础。我们采用改良酚水法提取纯化产黑普氏菌ATCC25845的LPS，通过动物和细胞模型研究LPS对机体免疫介质的诱导作用，以期为专性厌氧菌致病机理研究提供新的实验资料。
材料与方法
1.LPS提取、纯化、鉴定：产黑普氏菌标准菌株ATCC25845(本室保存)厌氧条件下接种于GAM厌氧培养基(北京新明技术研究所)，于厌氧培养箱37℃(80%氮气、10%氢气、10%二氧化碳)培养72小时，收集菌落。LPS提取采用Galanos的改良酚水法〔3〕。LPS纯度鉴定采用Folin酚和紫外吸收法分别测定蛋白和核酸含量。总磷测定采用钼蓝反应法〔4〕。氨基葡萄糖和酸性糖(KDO)含量分别采用苯甲醛比色法和锌巴比妥法进行〔5，6〕。
, 百拇医药
2.LPS对小鼠IL-1的诱导活性：参照Mizel的胸腺细胞增殖测定法进行〔7〕。动物采用C57BL/6小鼠，6～8周龄的用于制备巨噬细胞，3～4周龄的用于制备胸腺细胞。取小鼠腹腔巨噬细胞悬浮于1640培养液，分别加入不同剂量的LPS，置37℃二氧化碳培养箱培养约30小时，收集上清。小鼠胸腺细胞悬液用1640培养液调整细胞浓度为107/ml，96孔细胞培养板每孔加入0.1ml胸腺细胞悬液和0.1ml巨噬细胞培养上清(Con A 3μg/ml,Sigma)，同时设立阴性、细胞、细胞加丝裂原对照组。37℃ 5%二氧化碳培养72小时，收集前6小时每孔加入3H-TdR 18.5kBq(0.5μCi)/20μl(上海原子能所)，进行β计数，测定CPM值。
3.内毒素对小鼠集落刺激因子(CSF)的诱导作用：实验采用软琼脂单层细胞培养法进行〔8〕。昆明种小鼠分组，自尾静脉注射不同剂量LPS 0.2ml，注射后6小时自眼眶静脉取血，常规分离血清备用。小鼠骨髓细胞悬液制备采用小鼠单侧股骨，1640培养液冲出骨髓细胞，调整浓度为2×105/ml。CSF活性测定方法为常规制备软琼脂细胞培养基(1640培养基、20%马血清、0.3%琼脂、20%CSF小鼠稀释血清和0.1ml骨髓单细胞悬液)，每30mm培养皿加入1ml， 37℃ 5% 二氧化碳培养7天。低倍镜下计算集落生成单位(CFU)。
, 百拇医药
4.LPS对肿瘤坏死因子(TNF)的诱导活性：ICR小鼠随机分组，经腹腔注射BCG 2.5mg,2周后经腹腔注射不同剂量LPS 0.5ml，1.5小时后自眼眶静脉取血，常规分离血清备用。TNF活性测定方法为常规制备96孔L929细胞单层，37℃ 5%二氧化碳培养8小时。小鼠TNF血清用含放线菌素D的1640培养基二倍序列稀释，每孔0.1ml，继续培养20小时，MTT法测定每孔的光吸收值，计数得到的一组杀伤率与对应的稀释倍数的对数值作直线回归，求出TNF活性。
5.局部Shwartzman反应：依常规进行，纯系新西兰家兔，随机分组，背部皮内注射不同浓度LPS，以马流产杆菌LPS为平行对照。18小时后静脉注射50μg马流产杆菌LPS，4小时后记录结果。
结 果
1.LPS纯度鉴定：采用Folin-酚、紫外吸收等方法对提取的LPS进行了初步鉴定，结果见表1。结果显示，经改良酚水法提取的产黑普氏菌内毒素脂多糖，其蛋白和核酸含量均低于1%，具有很好的LPS纯度。
, 百拇医药
表1 纯化产黑普氏菌LPS生化鉴定
Table 1. Identification of the LPS prepared from P.m Nuclear
acid
Protein
Phosphate
KDO
Amino
sugar
<1%
<1%
5%
, 百拇医药
11.21%
20.01%
2.内毒素对IL-1的诱导活性：参照Mizel的小鼠胸腺细胞增殖测定法，对产黑普氏菌LPS的IL-1诱导活性进行了测定，结果见表2。结果显示，1ng的产黑普氏菌LPS即可刺激体外培养的小鼠巨噬细胞产生IL-1，并随着LPS剂量的增加，IL-1生成量也随之增加，但当剂量达到1μg时,IL-1水平反呈下降趋势。提示产黑普氏菌LPS对IL-1具有较强的诱导活性，并在一定剂量范围内呈剂量依赖型。其对IL-1的诱导活性高于大肠杆菌标准LPS。 表2 LPS对小鼠IL-1的诱导活性(cpm x±s)
Table 2. IL-1 release from macrophages induced by LPS(cpmx±s) LPS(ng)
1
, 百拇医药
10
100
1000
Control
P.m LPS
438±79
748±84
2106±284
1839±129
120±46
E.coli LPS*
355±74
, 百拇医药
755±83
1446±122
1442±221
*Standard LPS (Sigma)
3.内毒素对CSF的诱导活性：经静脉注射不同剂量的LPS后，小鼠血清中CSF水平明显增加，采用软琼脂细胞培养法测定，结果显示如表3。小鼠血清CSF水平在一定剂量范围内随LPS剂量增加而上升。小鼠骨髓细胞在CSF血清刺激下，在软琼脂培养基中形成由粒细胞和巨噬细胞组成的集落。大部分是粒-巨系，少数由单纯巨噬细胞组成。高倍镜下可见有成熟的、具有环状核的中性粒细胞以及形态不规则，核浆比1∶1的幼稚巨噬细胞。致密型居多。由此可见，LPS诱导的主要为单核-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。产黑普氏菌LPS的CSF诱导活性与大肠杆菌标准LPS无显著差别。
表3 LPS对小鼠血清CSF的诱导活性(集落形成单位CFU x±s)
, http://www.100md.com
Table 3.Enhancement of serum CSF induced by LPS in mice (CFU x±s) LPS(μg)
0.1
1.0
25
50
75
Control
P.m LPS
11.3±5.8
28.3±8.0
39.6±6.8
, http://www.100md.com
66.6±8.5
65.0±15.4
5.0±2.3
E.coli LPS*
15.1±6.0
26.2±3.4
38.3±8.8
55.0±4.2
56.3±7.2
* Standard LPS(Sigma)
4.产黑普氏菌LPS对小鼠血清TNF的诱导活性：经BCG致敏的小鼠，腹腔注射1μg的LPS，血清即可有TNF产生，并随LPS剂量增加而逐渐增高，而当LPS剂量达到50μg时，TNF水平不再明显上升。结果见表4。在LPS诱导小鼠TNF的模型中，TNF产生高峰位于1.5～3小时时相内，6小时后血中已测不到TNF活性。产黑普氏菌LPS可迅速刺激机体产生TNF，注射后1小时在血中即可测出TNF活性，并迅速在2小时达到峰值。其对TNF的诱导活性与大肠杆菌标准LPS无显著差别。
, http://www.100md.com
表4 产黑普氏菌LPS对小鼠血清TNF的诱导作用
Table 4. Inducement of serum TNF stimulated by LPS in mice (U/ml) LPS(μg)
0.1
1.0
10
25
50
Control
P.m LPS
4
24
, 百拇医药
1268
4825
4896
0
E.coli LPS*
8
14
962
4200
4864
*Standard LPS (Sigma)
5.局部斯氏反应(SPD50)：局部注射不同剂量的LPS，18小时后静脉注射50μg LPS，产黑普氏菌LPS诱发的局部斯氏反应的SPD50为64μg，大肠杆菌标准LPS为59μg。而平行对照的马流产杆菌LPS为8μg，与前二者之间存在显著差别。
, 百拇医药
讨 论
细菌LPS的致病作用通过激活单核巨噬细胞系统释放过量内源性细胞因子而实现，对于LPS敏感的动物，LPS和TNF均可引起一致的毒性反应。LPS和TNF介导致死反应的过程基本相似。因此LPS刺激机体产生过量细胞因子的能力，成为其致病作用强弱的重要指标。
IL-1除有免疫调节作用外，尚有介导多种病理作用。LPS是最有效的IL-1诱生剂。本实验中产黑普氏菌LPS表现出较强的IL-1介导能力，1ng的实验剂量即可刺激巨噬细胞产生IL-1，诱导活性高于大肠杆菌LPS，并在一定范围内呈现出剂量依赖型。产黑普氏菌常常出现在颌面部急性化脓性炎症中，是否与这种显著的IL-1诱导活性有关，尚待进一步研究。机体受到LPS刺激后，细胞合成CSF的速度明显增加，释放至体液中的CSF水平增高，这种情况下CSF生成增加可能是机体防御性反应的组成环节之一。本实验发现，小鼠血清CSF水平随产黑普氏菌LPS剂量的增加而上升，为一剂量依赖型曲线，0.1μg的LPS即可刺激CSF生成，其诱导强度与大肠杆菌LPS无显著差别，当剂量超过50μg时，CSF水平不再增加，反呈下降趋势。这可能与大剂量LPS产生的抑制作用有关，抑或大剂量LPS同时诱导了CSF抑制物，导致CSF水平降低。目前LPS对CSF的诱导活性在致病过程中意义尚不清楚。
, 百拇医药
在实验中，对TNF的测定由于加入放线菌素D以阻断L929细胞的防护机制，不仅使细胞对TNF的细胞毒呈现一致的反应性，而且阻断了活跃的代谢使靶细胞的敏感性增加，使检测时间大大缩短。本实验采用BCG诱导，2周后给予LPS，使小鼠产生高效价的TNF。结果表明，1μg的LPS可刺激小鼠产生TNF，并随LPS剂量增加而呈现剂量依赖型，产黑普氏菌LPS显著的TNF诱导能力在其致病过程中具有重要意义。研究发现，在颌面部感染组织中存在着LPS和TNF，其含量与炎症程度相关〔9，10〕，提示LPS和TNF在感染中所具有的致病作用。
产黑普氏菌LPS和大肠杆菌LPS均可刺激局部斯氏反应，皮肤出现典型的坏死病变，经改良酚水法提取的产黑普氏菌内毒素具有典型的LPS活性，在动物模型和体外实验中能有效地刺激机体产生IL-1、TNF、CSF以及局部斯氏反应。实验结果提示，产黑普氏菌LPS显著的细胞因子诱导活性可能是其致病作用的重要基础
参考文献
, 百拇医药
[1]Drucker DB,Lilley JD,Tucker D,et al.The endodontic microflora revisited .Microbios,1992,71∶288-292.
[2]Augthun M,Conrads G.Microbial findings of deep peri-implant bone defects.Int J Oral Maxillofac Implants,1997,12∶106-110.
[3]Galanos C,Luderitz O,Westphal O.Preparation and properties of a standardized lipopolysaccharide from Salmonella abortus equi. Zent Baktparasit Infekt Hyg.Abt I∶A.1979,243∶226-229.
, 百拇医药
[4]Lowry OH,Roberts NR,Leiner KY,et al.The quantitative histochemistry of brain.J Biol Chem,1954,207∶1-6.
[5]Strominger JL,Park JT,Thompson RE.Composition of the cell wall of Staphylococcus.J Biol Chem,1959,234∶3263-3268.
[6]Karkhanis D,Zeltner J.A new and improved microassay to determine KDO in lipopoplysaccharide of gram-negative bacteria.Anal Biochem,1978,87∶595-599.
[7]Mizel SB.Manual of Macrophage Methodology.Van Nostrand Reinhold Company.New York，1981,p407.
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[8]Sheng-Yuan Wang ,Charn-Yea Su.Effect of Lipopolysaccharide on the production of colonystimulating factor by the stromal cells in long-term bone marrow culture.Experimemtal Hematology,1991,19∶122-127.
[9]荫俊，史俊南.感染根管内毒素活性与临床症状间相互关系的研究.实用口腔医学杂志，1990，6∶243-246.
[10]荫俊，史俊南.炎症肉芽肿组织中肿瘤坏死因子的免疫组织化学研究.实用口腔医学杂志，1992，3∶161-164.
(收稿：1998-01-05 修回：1998-04-10), 百拇医药
单位：荫俊 张松年 侯晓军 陈跃峰 王忠泽(100071 北京，军事医学科学院微生物流行病研究所)；张郁 孙叶方(第四军医大学牙髓生物学实验室)
关键词：拟杆菌；产黑素；细胞因子；内毒素类
中华微生物学和免疫学杂志990202 【 摘要 】 目的 在体外细胞培养系统和小鼠模型中检测产黑普氏菌ATCC25845内毒素脂多糖对内源性细胞因子的介导活性。 方法 采用Kramer测定法、软琼脂细胞培养法和胸腺细胞增殖法测定内毒素脂多糖对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、集落刺激因子(colony stimulating factor,CSF)、白细胞介素1(interleukin1,IL-1)的诱导活性以及局部皮肤斯氏反应(SPD50)。结果 产黑普氏菌ATCC25845内毒素可显著地诱导TNF、CSF和IL-1的产生，在一定剂量范围内呈剂量依赖型。并可导致家兔典型的皮肤局部斯氏反应。 结论 产黑普氏菌ATCC25845内毒素脂多糖在动物模型中具有显著的炎症性细胞因子诱导活性。
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Production of cytokines induced by endotoxin prepared from Prevotella melaninogenica YIN Jun, ZHANG Songle, HOU Xiaojun, et al. Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071
【 Abstract 】 Objective To explore the cyto-immunological effect of endotoxin prepared from P. melaninogenicus (P.m) ATCC25845 on the production of interlukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor (TNF), colony stimulating factor (CSF) and Shwartzman preparatory Dose50 (SPD50) both in cell cultures and mice. Methods Kramer's method, soft agar cell culture and thymocyte proliferation were applied for testing the effects . Results The results demonstrated that IL-1 could be produced at dose 1.0ng of endotoxin. And the levels of IL-1 were correlated with the doses of endotoxin. The endotoxin could also induce production of sera TNF at a dose of 1.0μg in mice. TNF could be found in sera of mice after endotoxin injection one hour later and disappeared within six hours. The results still revealed that the endotoxin of P. m had an inducing activity on macrophages of mice in production CSF at a dose 0.1μg and was dose dependent. The SPD50 of P.m endotoxin was 64μg in local Shwartzman reaction. Conclusion These results demonstrate that the inducing activities of P.m endotoxin on cytokines may be important for its pathogenesis in clinical infection.
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【 Subject words 】 Prevotella melaninogenica Cytokines Endotoxin
产黑普氏菌(Prevotella melaninogenica,P.m)为革兰氏阴性专性厌氧菌。广泛存在于口腔、消化道、呼吸道和泌尿生殖道，是临床厌氧菌感染的重要致病菌〔1，2〕。由于专性厌氧培养条件的限制，对其致病机理的研究较少。内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作为一种强免疫原，可启动机体多种免疫反应。研究产黑普氏菌内毒素的免疫生物学活性，有助于了解其致病作用的分子基础。我们采用改良酚水法提取纯化产黑普氏菌ATCC25845的LPS，通过动物和细胞模型研究LPS对机体免疫介质的诱导作用，以期为专性厌氧菌致病机理研究提供新的实验资料。
材料与方法
1.LPS提取、纯化、鉴定：产黑普氏菌标准菌株ATCC25845(本室保存)厌氧条件下接种于GAM厌氧培养基(北京新明技术研究所)，于厌氧培养箱37℃(80%氮气、10%氢气、10%二氧化碳)培养72小时，收集菌落。LPS提取采用Galanos的改良酚水法〔3〕。LPS纯度鉴定采用Folin酚和紫外吸收法分别测定蛋白和核酸含量。总磷测定采用钼蓝反应法〔4〕。氨基葡萄糖和酸性糖(KDO)含量分别采用苯甲醛比色法和锌巴比妥法进行〔5，6〕。
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2.LPS对小鼠IL-1的诱导活性：参照Mizel的胸腺细胞增殖测定法进行〔7〕。动物采用C57BL/6小鼠，6～8周龄的用于制备巨噬细胞，3～4周龄的用于制备胸腺细胞。取小鼠腹腔巨噬细胞悬浮于1640培养液，分别加入不同剂量的LPS，置37℃二氧化碳培养箱培养约30小时，收集上清。小鼠胸腺细胞悬液用1640培养液调整细胞浓度为107/ml，96孔细胞培养板每孔加入0.1ml胸腺细胞悬液和0.1ml巨噬细胞培养上清(Con A 3μg/ml,Sigma)，同时设立阴性、细胞、细胞加丝裂原对照组。37℃ 5%二氧化碳培养72小时，收集前6小时每孔加入3H-TdR 18.5kBq(0.5μCi)/20μl(上海原子能所)，进行β计数，测定CPM值。
3.内毒素对小鼠集落刺激因子(CSF)的诱导作用：实验采用软琼脂单层细胞培养法进行〔8〕。昆明种小鼠分组，自尾静脉注射不同剂量LPS 0.2ml，注射后6小时自眼眶静脉取血，常规分离血清备用。小鼠骨髓细胞悬液制备采用小鼠单侧股骨，1640培养液冲出骨髓细胞，调整浓度为2×105/ml。CSF活性测定方法为常规制备软琼脂细胞培养基(1640培养基、20%马血清、0.3%琼脂、20%CSF小鼠稀释血清和0.1ml骨髓单细胞悬液)，每30mm培养皿加入1ml， 37℃ 5% 二氧化碳培养7天。低倍镜下计算集落生成单位(CFU)。
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4.LPS对肿瘤坏死因子(TNF)的诱导活性：ICR小鼠随机分组，经腹腔注射BCG 2.5mg,2周后经腹腔注射不同剂量LPS 0.5ml，1.5小时后自眼眶静脉取血，常规分离血清备用。TNF活性测定方法为常规制备96孔L929细胞单层，37℃ 5%二氧化碳培养8小时。小鼠TNF血清用含放线菌素D的1640培养基二倍序列稀释，每孔0.1ml，继续培养20小时，MTT法测定每孔的光吸收值，计数得到的一组杀伤率与对应的稀释倍数的对数值作直线回归，求出TNF活性。
5.局部Shwartzman反应：依常规进行，纯系新西兰家兔，随机分组，背部皮内注射不同浓度LPS，以马流产杆菌LPS为平行对照。18小时后静脉注射50μg马流产杆菌LPS，4小时后记录结果。
结 果
1.LPS纯度鉴定：采用Folin-酚、紫外吸收等方法对提取的LPS进行了初步鉴定，结果见表1。结果显示，经改良酚水法提取的产黑普氏菌内毒素脂多糖，其蛋白和核酸含量均低于1%，具有很好的LPS纯度。
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表1 纯化产黑普氏菌LPS生化鉴定
Table 1. Identification of the LPS prepared from P.m Nuclear
acid
Protein
Phosphate
KDO
Amino
sugar
<1%
<1%
5%
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11.21%
20.01%
2.内毒素对IL-1的诱导活性：参照Mizel的小鼠胸腺细胞增殖测定法，对产黑普氏菌LPS的IL-1诱导活性进行了测定，结果见表2。结果显示，1ng的产黑普氏菌LPS即可刺激体外培养的小鼠巨噬细胞产生IL-1，并随着LPS剂量的增加，IL-1生成量也随之增加，但当剂量达到1μg时,IL-1水平反呈下降趋势。提示产黑普氏菌LPS对IL-1具有较强的诱导活性，并在一定剂量范围内呈剂量依赖型。其对IL-1的诱导活性高于大肠杆菌标准LPS。 表2 LPS对小鼠IL-1的诱导活性(cpm x±s)
Table 2. IL-1 release from macrophages induced by LPS(cpmx±s) LPS(ng)
1
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10
100
1000
Control
P.m LPS
438±79
748±84
2106±284
1839±129
120±46
E.coli LPS*
355±74
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755±83
1446±122
1442±221
*Standard LPS (Sigma)
3.内毒素对CSF的诱导活性：经静脉注射不同剂量的LPS后，小鼠血清中CSF水平明显增加，采用软琼脂细胞培养法测定，结果显示如表3。小鼠血清CSF水平在一定剂量范围内随LPS剂量增加而上升。小鼠骨髓细胞在CSF血清刺激下，在软琼脂培养基中形成由粒细胞和巨噬细胞组成的集落。大部分是粒-巨系，少数由单纯巨噬细胞组成。高倍镜下可见有成熟的、具有环状核的中性粒细胞以及形态不规则，核浆比1∶1的幼稚巨噬细胞。致密型居多。由此可见，LPS诱导的主要为单核-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。产黑普氏菌LPS的CSF诱导活性与大肠杆菌标准LPS无显著差别。
表3 LPS对小鼠血清CSF的诱导活性(集落形成单位CFU x±s)
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Table 3.Enhancement of serum CSF induced by LPS in mice (CFU x±s) LPS(μg)
0.1
1.0
25
50
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Control
P.m LPS
11.3±5.8
28.3±8.0
39.6±6.8
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66.6±8.5
65.0±15.4
5.0±2.3
E.coli LPS*
15.1±6.0
26.2±3.4
38.3±8.8
55.0±4.2
56.3±7.2
* Standard LPS(Sigma)
4.产黑普氏菌LPS对小鼠血清TNF的诱导活性：经BCG致敏的小鼠，腹腔注射1μg的LPS，血清即可有TNF产生，并随LPS剂量增加而逐渐增高，而当LPS剂量达到50μg时，TNF水平不再明显上升。结果见表4。在LPS诱导小鼠TNF的模型中，TNF产生高峰位于1.5～3小时时相内，6小时后血中已测不到TNF活性。产黑普氏菌LPS可迅速刺激机体产生TNF，注射后1小时在血中即可测出TNF活性，并迅速在2小时达到峰值。其对TNF的诱导活性与大肠杆菌标准LPS无显著差别。
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表4 产黑普氏菌LPS对小鼠血清TNF的诱导作用
Table 4. Inducement of serum TNF stimulated by LPS in mice (U/ml) LPS(μg)
0.1
1.0
10
25
50
Control
P.m LPS
4
24
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1268
4825
4896
0
E.coli LPS*
8
14
962
4200
4864
*Standard LPS (Sigma)
5.局部斯氏反应(SPD50)：局部注射不同剂量的LPS，18小时后静脉注射50μg LPS，产黑普氏菌LPS诱发的局部斯氏反应的SPD50为64μg，大肠杆菌标准LPS为59μg。而平行对照的马流产杆菌LPS为8μg，与前二者之间存在显著差别。
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讨 论
细菌LPS的致病作用通过激活单核巨噬细胞系统释放过量内源性细胞因子而实现，对于LPS敏感的动物，LPS和TNF均可引起一致的毒性反应。LPS和TNF介导致死反应的过程基本相似。因此LPS刺激机体产生过量细胞因子的能力，成为其致病作用强弱的重要指标。
IL-1除有免疫调节作用外，尚有介导多种病理作用。LPS是最有效的IL-1诱生剂。本实验中产黑普氏菌LPS表现出较强的IL-1介导能力，1ng的实验剂量即可刺激巨噬细胞产生IL-1，诱导活性高于大肠杆菌LPS，并在一定范围内呈现出剂量依赖型。产黑普氏菌常常出现在颌面部急性化脓性炎症中，是否与这种显著的IL-1诱导活性有关，尚待进一步研究。机体受到LPS刺激后，细胞合成CSF的速度明显增加，释放至体液中的CSF水平增高，这种情况下CSF生成增加可能是机体防御性反应的组成环节之一。本实验发现，小鼠血清CSF水平随产黑普氏菌LPS剂量的增加而上升，为一剂量依赖型曲线，0.1μg的LPS即可刺激CSF生成，其诱导强度与大肠杆菌LPS无显著差别，当剂量超过50μg时，CSF水平不再增加，反呈下降趋势。这可能与大剂量LPS产生的抑制作用有关，抑或大剂量LPS同时诱导了CSF抑制物，导致CSF水平降低。目前LPS对CSF的诱导活性在致病过程中意义尚不清楚。
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在实验中，对TNF的测定由于加入放线菌素D以阻断L929细胞的防护机制，不仅使细胞对TNF的细胞毒呈现一致的反应性，而且阻断了活跃的代谢使靶细胞的敏感性增加，使检测时间大大缩短。本实验采用BCG诱导，2周后给予LPS，使小鼠产生高效价的TNF。结果表明，1μg的LPS可刺激小鼠产生TNF，并随LPS剂量增加而呈现剂量依赖型，产黑普氏菌LPS显著的TNF诱导能力在其致病过程中具有重要意义。研究发现，在颌面部感染组织中存在着LPS和TNF，其含量与炎症程度相关〔9，10〕，提示LPS和TNF在感染中所具有的致病作用。
产黑普氏菌LPS和大肠杆菌LPS均可刺激局部斯氏反应，皮肤出现典型的坏死病变，经改良酚水法提取的产黑普氏菌内毒素具有典型的LPS活性，在动物模型和体外实验中能有效地刺激机体产生IL-1、TNF、CSF以及局部斯氏反应。实验结果提示，产黑普氏菌LPS显著的细胞因子诱导活性可能是其致病作用的重要基础
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(收稿：1998-01-05 修回：1998-04-10), 百拇医药