碱性成纤维细胞生长因子对兔血管舒张功能及左旋精氨酸/一氧化氮途径的影响
作者：王晓红 姜志胜 迪丽努尔.莎比托夫 庞永政 刘初峰 唐朝枢
单位：北京医科大学心血管基础研究所病理生理室(北京 100083)
关键词：成纤维细胞生长因子；碱性；一氧化氮；精氨酸
碱性成纤维细胞生长因子对兔血管舒张功能及左旋精氨酸 摘 要 目的：本文观察了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对离体主动脉舒张反应，一氧化氮(NO)生成及左旋精氨酸(L-Arg)转运的影响。方法：离体大鼠主动脉环测定张力，主动脉薄片孵育测定NO生成和L-精氨酸(L-Arg)转运。结果：bFGF呈剂量依赖性地诱导血管内皮依赖性舒张，增加血管低亲和L-Arg的最大转运速度(与对照组比较增加45%，P<0.01),显著增加NO的产生(比对照组增加43%)。结论：bFGF可增加L-Arg转运，对内皮衍生舒张因子/一氧化氮(EDRF/NO)系统具有重要的调节作用。
, 百拇医药
The effects of basic fibroblast growth factor on aortic relaxation and L-arginine/nitric oxide system
WANG Xiao-Hong, JIANG Zhi-Sheng, Dili Nur Shabituofu,PANG Yong-Zhong
LIU Chu-Feng, TANG Chao-Shu
Basic Research Lab. of Pathophysiology, Cardiovascular Institute, Beijing Medical University, Beijing (100083)
Abstract AIM:To study the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on aortic relaxation, nitric oxide(NO) production, and L-arginine(L-Arg) transport of rabbit in vitro. METHODS:Vascular tone was measured with bath of isolated rat aortic ring. NO formation and L-arginine transport were assayed by aortic slice incubation. RESULTS:bFGF could induced endothelium-dependent aortic relaxation in dose dependent manner. When incubated with bFGF, aortic slices could produce NO about 43% more than that of control group, and the maximal viscosity of low affinity L-Arg transport was promoted by bFGF. CONCLUSION:bFGF might affect L-Arg/NO system to different extents.
, http://www.100md.com
MeSH Fibroblast growth factor，basic; Nitric oxide; Arginine
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是体内广泛分布的多功能生长因子，对细胞的发育、分化、移行、增殖及新生血管形成具有重要的调节作用。近年研究发现，bFGF还具有扩张血管效应[1]，能诱导血管一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的合成，拮抗高血压，缺少bFGF可引起高血压发生，推测bFGF是内皮衍生舒张因子(endothelial derived relaxing factor, EDRF)/一氧化氮(nitric oxide, NO)的重要调节因素[2]，但其作用机理尚不清楚。本实验观察bFGF对离体家兔主动脉血管舒张反应、NO生成和左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)转运的影响，探讨bFGF对血管L-Arg/NO途径的作用环节。
, http://www.100md.com
材料与方法
大耳白兔由本校动物中心提供，重组人bFGF为北京白鹭园生物技术公司提供，[3H]-Arg为Dupont产品，余为市售分析纯试剂。
雌性大耳白兔5只，体重2.5～3 kg,1%普鲁卡因3～5 mL局部麻醉，经动脉放血处死，快速摘取全部胸主动脉组织用于下述实验。
一、血管舒张反应测定[3]：
取约3 mm长胸主动脉环两段，分别保留内皮和擦拭去内皮，置于37℃，体积分数为95% O2-5%CO2平衡的Krebs-Henseleit(KH)液含10-7 mmol/L消炎痛的浴槽中，经调节静止张力0.5 g，10-7 mol/L去甲肾上腺素(NE)收缩达平台后，分别加入不同浓度的bFGF，经张力换能器，在记录仪上记录其舒张反应。
, 百拇医药
二、主动脉薄片孵育：
按Abbort等[4]方法制备主动脉0.5 mm厚薄片，按每50 mg湿重加入1 mL KH液，实验分为对照组和bFGF组(bFGF终浓度为100 μg/L),在37℃恒温振荡水浴上，通体积分数为95% O2-5%CO2持续孵育3 h，然后进行下述测定。
三、孵育液NO-2测定：
取孵育液1 mL按Green等[5]方法，测定NO终末代谢产物NO-2含量，以nmol/mg WW表示。
四、主动脉[3H]-L-Arg转运测定[6]：
, 百拇医药
分组及血管薄片孵育方法同上，孵育3 h后，加入[3H]-L-Arg浓度为0.01～10 mmol/L，孵育1 min，立即用2 mL冷的KH液终止反应，并充洗3次，取出组织用0.5 mL甲酸消化考马斯亮兰法测定消化液蛋白含量。取0.2 mL消化液，加入闪烁液，在β闪烁计数仪(FJ-2170)上测定放射强度，计算摄入的Arg量，以nmol.min-1.mg-1蛋白表示。
实验结果以
±s表示，方差分析，组间q检验作统计学处理。
结果
一、bFGF具有内皮依赖的舒张血管作用：
, http://www.100md.com
对NE收缩的血管，bFGF有浓度依赖的舒张作用，Emax为(2.82±0.46)g，EC50为(23.27±4.60)nmol/L,去内皮组血管对bFGF的舒张反应显著低于对照组Emax为(0.40±0.06)g,EC50为(6.60±0.58)nmol/L(P<0.01)，结果见图1所示。
二、bFGF刺激主动脉NO释放：
对照组和加bFGF组(100 μg/L)孵育液NO-2含量分别为(5.60±0.34)nmol/mg.pr(n＝5)和(7.99±0.52)nmol/mg pr(n=5)，比对照组增加43%。
, 百拇医药
Fig 1 Effects of bFGF on aortic relaxation in rabbit (
±s, n=5)
图1 bFGF对兔主动脉舒张反应的影响 三、bFGF促进[3H]-Arg的转运：
主动脉组织对L-Arg转运呈高和低亲和两种方式，见图2所示，用Eadie-Hofstee Plot分析，bFGF孵育虽然增加血管低亲和转运的最大速度Vmax(45%,P<0.01)，但不影响高亲和转运Vmax，也不影响高和低亲和的K(m)值，结果见表1所示。
表1 bFGF对兔主动脉L-Arg转运最大速率及米氏常数影响
, 百拇医药
Tab 1 Effects of bFGF on aortic L-Arg transport(
±s,n=5)
Transport Vmax (nmol.min-1.mg-1)
K(m)(nmol/L)
Low affinity
High affinity
Low affinity
, 百拇医药
High affinity
Control
9.60±1.13
2.03±0.24
1.09±0.09
0.028±0.001
bFGF
13.95±1.73**
1.99±0.26
1.24±0.09
0.029±0.001
, 百拇医药
**P<0.01，vs control
Fig 2 Effects of bFGF on kinetics of aortic [3 H]-L-Arg transport in rabbit(
±s，n＝5)
图2 bFGF对兔主动脉组织[3H]-L-Arg转运动力学的影响
讨论
, 百拇医药
bFGF作为丝裂源对细胞生长、发育、增殖调节及其机理已被广泛研究。近年发现bFGF有直接扩血管作用，增加心肌缺血/再灌的冠脉流量[7]和抗高血压作用[1]，提示该因子是血管张力的重要调节因素。有研究表明bFGF可诱导NOS活性，促进NO产生[8]，但对NO产生的具体环节(L-Arg/NO途径)的作用尚未完全阐明。
细胞内NO由L-Arg经NOS催化生成，底物L-Arg主要源于血浆，经细胞膜上的转运蛋白(Na+-依赖性Y+型transporter)进入细胞内库存利用[9]。
本实验发现，离体血管条灌流时，灌流液中加入不同浓度bFGF可明显促进血管的舒张，并具有剂量依赖性和内皮依赖性。去内皮组较对照组(完整内皮组)Emax下降约6倍，EC50下降3倍。为进一步探讨bFGF的扩血管机理，本实验利用血管薄片孵育的方法，观察了bFGF对L-Arg/NO系统的影响，发现主动脉组织对L-Arg的转运有两种形式：高和低亲和转运。bFGF促进低亲和力L-Arg转运，其Vmax较对照组增加45%，但不影响高亲和转运的Vmax，也不影响高和低亲和的K(m)值。bFGF亦使血管孵育液中NO的代谢终末产物NO-2增加，由此可见bFGF对血管L-Arg/NO途径有不同程度的影响，调节L-Arg/NO的生理、病理意义值得高度重视。
, 百拇医药
参考文献
1 Cuevas P, Carceller F, Orltega S，et al. Hypotensive activity of fibroblast growth factor. Science, 1991, 254:12108.
2 Cueves P, Calvo MG, Carceller F，et al. Correction of hypertension by normalization of endothelial levels of fibroblast growth factor and nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rat. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:11996.
3 Nielso KC, Olnmane. Contratile response and amine receptor mechanism in isolated middle cerebral artery of the cat. Brain Res, 1997, 27:33.
, http://www.100md.com
4 Abbort RE,Schachter D. Regional differentiation in rat aorta:L-arginine metabolism and cGMP content in vitro. Am J Physiol, 1994, 266:H2287.
5 Green LG, Wangner DA, Glogomski J,et al. Analysis of nitrate (15CN)-nitrited in biological fluids. Anal Biochem,1982, 126:131.
6 Drurante W, Liao L, Schafer Al. Differential regulation of L-arginine transport and inducible NOS in cultured vascular smooth muscle cells. Am J Physiol, 1995, 288:H1158.
, http://www.100md.com
7 周 兰，常英资，邱宗荫，等.碱性成纤维细胞生长因子对缺血/再灌大鼠的保护作用.基础医学与临床，1997，17(4)：273.
8 Kostyk KC, Kourembanas S, Wheeler EL, et al. Basic fibroblast growth factor increases nitric oxide synthase production in bovine endothelial cells.Am J Physiol, 1995, 269:H1583.
9 Durante W, Liao L, Iftikhar I, et al. Differential regulation of L-Arginine transport and nitric oxide production by vascular smooth muscle and endothelium. Circ Res, 1996,78:1075.
1997年6月2日收稿，1997年11月18日修回, http://www.100md.com
单位：北京医科大学心血管基础研究所病理生理室(北京 100083)
关键词：成纤维细胞生长因子；碱性；一氧化氮；精氨酸
碱性成纤维细胞生长因子对兔血管舒张功能及左旋精氨酸 摘 要 目的：本文观察了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对离体主动脉舒张反应，一氧化氮(NO)生成及左旋精氨酸(L-Arg)转运的影响。方法：离体大鼠主动脉环测定张力，主动脉薄片孵育测定NO生成和L-精氨酸(L-Arg)转运。结果：bFGF呈剂量依赖性地诱导血管内皮依赖性舒张，增加血管低亲和L-Arg的最大转运速度(与对照组比较增加45%，P<0.01),显著增加NO的产生(比对照组增加43%)。结论：bFGF可增加L-Arg转运，对内皮衍生舒张因子/一氧化氮(EDRF/NO)系统具有重要的调节作用。
, 百拇医药
The effects of basic fibroblast growth factor on aortic relaxation and L-arginine/nitric oxide system
WANG Xiao-Hong, JIANG Zhi-Sheng, Dili Nur Shabituofu,PANG Yong-Zhong
LIU Chu-Feng, TANG Chao-Shu
Basic Research Lab. of Pathophysiology, Cardiovascular Institute, Beijing Medical University, Beijing (100083)
Abstract AIM:To study the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on aortic relaxation, nitric oxide(NO) production, and L-arginine(L-Arg) transport of rabbit in vitro. METHODS:Vascular tone was measured with bath of isolated rat aortic ring. NO formation and L-arginine transport were assayed by aortic slice incubation. RESULTS:bFGF could induced endothelium-dependent aortic relaxation in dose dependent manner. When incubated with bFGF, aortic slices could produce NO about 43% more than that of control group, and the maximal viscosity of low affinity L-Arg transport was promoted by bFGF. CONCLUSION:bFGF might affect L-Arg/NO system to different extents.
, http://www.100md.com
MeSH Fibroblast growth factor，basic; Nitric oxide; Arginine
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是体内广泛分布的多功能生长因子，对细胞的发育、分化、移行、增殖及新生血管形成具有重要的调节作用。近年研究发现，bFGF还具有扩张血管效应[1]，能诱导血管一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的合成，拮抗高血压，缺少bFGF可引起高血压发生，推测bFGF是内皮衍生舒张因子(endothelial derived relaxing factor, EDRF)/一氧化氮(nitric oxide, NO)的重要调节因素[2]，但其作用机理尚不清楚。本实验观察bFGF对离体家兔主动脉血管舒张反应、NO生成和左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)转运的影响，探讨bFGF对血管L-Arg/NO途径的作用环节。
, http://www.100md.com
材料与方法
大耳白兔由本校动物中心提供，重组人bFGF为北京白鹭园生物技术公司提供，[3H]-Arg为Dupont产品，余为市售分析纯试剂。
雌性大耳白兔5只，体重2.5～3 kg,1%普鲁卡因3～5 mL局部麻醉，经动脉放血处死，快速摘取全部胸主动脉组织用于下述实验。
一、血管舒张反应测定[3]：
取约3 mm长胸主动脉环两段，分别保留内皮和擦拭去内皮，置于37℃，体积分数为95% O2-5%CO2平衡的Krebs-Henseleit(KH)液含10-7 mmol/L消炎痛的浴槽中，经调节静止张力0.5 g，10-7 mol/L去甲肾上腺素(NE)收缩达平台后，分别加入不同浓度的bFGF，经张力换能器，在记录仪上记录其舒张反应。
, 百拇医药
二、主动脉薄片孵育：
按Abbort等[4]方法制备主动脉0.5 mm厚薄片，按每50 mg湿重加入1 mL KH液，实验分为对照组和bFGF组(bFGF终浓度为100 μg/L),在37℃恒温振荡水浴上，通体积分数为95% O2-5%CO2持续孵育3 h，然后进行下述测定。
三、孵育液NO-2测定：
取孵育液1 mL按Green等[5]方法，测定NO终末代谢产物NO-2含量，以nmol/mg WW表示。
四、主动脉[3H]-L-Arg转运测定[6]：
, 百拇医药
分组及血管薄片孵育方法同上，孵育3 h后，加入[3H]-L-Arg浓度为0.01～10 mmol/L，孵育1 min，立即用2 mL冷的KH液终止反应，并充洗3次，取出组织用0.5 mL甲酸消化考马斯亮兰法测定消化液蛋白含量。取0.2 mL消化液，加入闪烁液，在β闪烁计数仪(FJ-2170)上测定放射强度，计算摄入的Arg量，以nmol.min-1.mg-1蛋白表示。
实验结果以
±s表示，方差分析，组间q检验作统计学处理。结果
一、bFGF具有内皮依赖的舒张血管作用：
, http://www.100md.com
对NE收缩的血管，bFGF有浓度依赖的舒张作用，Emax为(2.82±0.46)g，EC50为(23.27±4.60)nmol/L,去内皮组血管对bFGF的舒张反应显著低于对照组Emax为(0.40±0.06)g,EC50为(6.60±0.58)nmol/L(P<0.01)，结果见图1所示。
二、bFGF刺激主动脉NO释放：
对照组和加bFGF组(100 μg/L)孵育液NO-2含量分别为(5.60±0.34)nmol/mg.pr(n＝5)和(7.99±0.52)nmol/mg pr(n=5)，比对照组增加43%。
, 百拇医药
Fig 1 Effects of bFGF on aortic relaxation in rabbit (
±s, n=5)图1 bFGF对兔主动脉舒张反应的影响 三、bFGF促进[3H]-Arg的转运：
主动脉组织对L-Arg转运呈高和低亲和两种方式，见图2所示，用Eadie-Hofstee Plot分析，bFGF孵育虽然增加血管低亲和转运的最大速度Vmax(45%,P<0.01)，但不影响高亲和转运Vmax，也不影响高和低亲和的K(m)值，结果见表1所示。
表1 bFGF对兔主动脉L-Arg转运最大速率及米氏常数影响
, 百拇医药
Tab 1 Effects of bFGF on aortic L-Arg transport(
±s,n=5)Transport Vmax (nmol.min-1.mg-1)
K(m)(nmol/L)
Low affinity
High affinity
Low affinity
, 百拇医药
High affinity
Control
9.60±1.13
2.03±0.24
1.09±0.09
0.028±0.001
bFGF
13.95±1.73**
1.99±0.26
1.24±0.09
0.029±0.001
, 百拇医药
**P<0.01，vs control
Fig 2 Effects of bFGF on kinetics of aortic [3 H]-L-Arg transport in rabbit(
±s，n＝5)图2 bFGF对兔主动脉组织[3H]-L-Arg转运动力学的影响
讨论
, 百拇医药
bFGF作为丝裂源对细胞生长、发育、增殖调节及其机理已被广泛研究。近年发现bFGF有直接扩血管作用，增加心肌缺血/再灌的冠脉流量[7]和抗高血压作用[1]，提示该因子是血管张力的重要调节因素。有研究表明bFGF可诱导NOS活性，促进NO产生[8]，但对NO产生的具体环节(L-Arg/NO途径)的作用尚未完全阐明。
细胞内NO由L-Arg经NOS催化生成，底物L-Arg主要源于血浆，经细胞膜上的转运蛋白(Na+-依赖性Y+型transporter)进入细胞内库存利用[9]。
本实验发现，离体血管条灌流时，灌流液中加入不同浓度bFGF可明显促进血管的舒张，并具有剂量依赖性和内皮依赖性。去内皮组较对照组(完整内皮组)Emax下降约6倍，EC50下降3倍。为进一步探讨bFGF的扩血管机理，本实验利用血管薄片孵育的方法，观察了bFGF对L-Arg/NO系统的影响，发现主动脉组织对L-Arg的转运有两种形式：高和低亲和转运。bFGF促进低亲和力L-Arg转运，其Vmax较对照组增加45%，但不影响高亲和转运的Vmax，也不影响高和低亲和的K(m)值。bFGF亦使血管孵育液中NO的代谢终末产物NO-2增加，由此可见bFGF对血管L-Arg/NO途径有不同程度的影响，调节L-Arg/NO的生理、病理意义值得高度重视。
, 百拇医药
参考文献
1 Cuevas P, Carceller F, Orltega S，et al. Hypotensive activity of fibroblast growth factor. Science, 1991, 254:12108.
2 Cueves P, Calvo MG, Carceller F，et al. Correction of hypertension by normalization of endothelial levels of fibroblast growth factor and nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rat. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:11996.
3 Nielso KC, Olnmane. Contratile response and amine receptor mechanism in isolated middle cerebral artery of the cat. Brain Res, 1997, 27:33.
, http://www.100md.com
4 Abbort RE,Schachter D. Regional differentiation in rat aorta:L-arginine metabolism and cGMP content in vitro. Am J Physiol, 1994, 266:H2287.
5 Green LG, Wangner DA, Glogomski J,et al. Analysis of nitrate (15CN)-nitrited in biological fluids. Anal Biochem,1982, 126:131.
6 Drurante W, Liao L, Schafer Al. Differential regulation of L-arginine transport and inducible NOS in cultured vascular smooth muscle cells. Am J Physiol, 1995, 288:H1158.
, http://www.100md.com
7 周 兰，常英资，邱宗荫，等.碱性成纤维细胞生长因子对缺血/再灌大鼠的保护作用.基础医学与临床，1997，17(4)：273.
8 Kostyk KC, Kourembanas S, Wheeler EL, et al. Basic fibroblast growth factor increases nitric oxide synthase production in bovine endothelial cells.Am J Physiol, 1995, 269:H1583.
9 Durante W, Liao L, Iftikhar I, et al. Differential regulation of L-Arginine transport and nitric oxide production by vascular smooth muscle and endothelium. Circ Res, 1996,78:1075.
1997年6月2日收稿，1997年11月18日修回, http://www.100md.com