成熟心肌细胞的分离与培养方法
作者：李予蓉 商立军 范风云
单位：李予蓉(第四军医大学：预防医学系放射医学教研室， 陕西 西安 710033)；商立军(第四军医大学：基础部生理学教研室， 陕西 西安 710033)；范风云(第四军医大学：西京医院放射治疗科， 陕西 西安 710033)
关键词：成熟心肌细胞；分离；原代培养
第四军医大学学报000676 中图号：Q831.11 文献标识码：B
文章编号：1000-2790(2000)06-S0153-01
0 引言
我们介绍一种在无血清培养基中分离和培养成熟心肌细胞的方法[1,2]，着重强调对优化心肌细胞培养至关重要的分离过程.
, 百拇医药
1 材料
分离装置可用典型的Langandorff装置，配合无菌操作要求，对心脏进行逆行灌注. 基本灌流液(溶液A)，是用纯水和高纯度试剂制备，其成分有(mmol.L-1)：NaCl 130; HEPES 23；葡萄糖21；牛磺酸20；肌酸5；MgCl2 5；丙酮酸钠5；KCl 4.5；NaH2PO4 1；pH7.3. 过滤(0.2 μm滤纸片)溶液除去微生物和水颗粒. A溶液是分离过程中使用的其他4种溶液的原料：①750 μmol.L-1 Ca2+溶液(300 mL A溶液+750 μmol.L-1 Ca2+); ②游离Ca2++EGTA溶液(300 mL A溶液+3.3 μmol.L-1 EGTA); ③酶溶液(80 mL A溶液+100 μmol.L-1 Ca2+, 1 g.L-1天然胶原酶和0.1 g.L-1蛋白酶); ④“酶洗脱”液(220 mL A溶液+100 μmol.L-1 Ca2+). 常规用来培养成熟心脏细胞的基础的、非补充培养基是碳酸氢盐缓冲培养基 199. 一般补充成分有(mmol.L-1)：肌酸5；牛磺酸5；L-肉毒碱2；丙酮酸2.5；胰岛素0.1 μmol.L-1. 为防止细菌感染，所有介质均含有青霉素50 U和链霉素50 mg.L-1. 细胞保存于恒温箱无菌环境中，50 mL.L-1 CO2～950 mL.L-1空气的气体环境中37℃. 吸附底物预处理培养基表面 可使用塑料或玻璃. 玻璃盖片在使用前用700 mL.L-1乙醇清洗，水冲洗并自动吸附. 有人提出用硝酸蚀刻玻璃以达到最佳吸附效果，但这不是必需的. 层粘连蛋白最终要在一定量磷酸盐缓冲盐水或培养基中稀释至15 mg.L-1的浓度. 这些盐水和培养基需足以覆盖培养物表面. 层粘连蛋白在铺开细胞前至少30 min就会吸附到培养皿上.
, 百拇医药
2 方法
脱颈处死动物，无菌条件下打开胸腔，取出心脏，在冰冷的(4℃) 750 μmol.L-1 Ca2+溶液中轻轻挤压心脏几次，以除去冠状血管中的血液. 将主动脉系在套管上，并用750 μmol.L-1Ca2+溶液灌注心脏. 2 min后转用无Ca2+的EGTA溶液灌流5 min. 用酶溶液灌注心脏8～14 min，当酶开始分解消化心脏时，流出心脏的液体变的越来越粘稠，并被收集进行再循环. 酶消化到最后，用100 μmol.L-1 Ca2+溶液洗5 min，将酶溶液洗出. 然后将心脏割离套管，割去心房和主动脉. 在灭菌的皮氏培养皿上，用小剪刀剪碎心室组织，将组织旋转在振摇烧瓶中，浸于50 mL 100 μmol.L-1 Ca2+溶液中，并在37℃下轻轻摇动以机械性分离心肌细胞. 同时给被消化组织充氧，充氧亦应温和. 振荡5～10 min后，过滤心肌细胞. 50 g离心1 min后，先用500 μmol.L-1 Ca2+溶液置换上清液，再用1 mol.L-1 Ca2+溶液置换. 温和的离心过程丢弃了大多数非心肌细胞、死亡细胞或高度收缩的心肌细胞. 有些实验室发现，用40 mL.L-1牛血清白蛋白离心或进行密度梯度离心，可进一步增加柱形心肌细胞的含量. 最后，细胞在培养基中再次悬浮并铺开[2]. 为了将心肌细胞以合适的密度铺开，可在4 mol.L-1 Ca2+溶液中用血细胞计数器对一小样本进行计数. 合适数目的细胞进行离心，而后在培养基的整个容积范围内再次悬浮，该培养基应足以覆盖培养物表面，心肌细胞可以按104.cm-2柱形细胞的密度铺开. 一旦心肌细胞被铺开，则将其放置4 h完成吸附. 这段时间过后轻轻更换介质，除去所有未吸附的细胞。培养的心肌细胞对切应力和介质骚动很敏感，因此介质更换必须缓慢而小心. 第1次介质更换后，每隔3 d更换1次，介质需要预先用50 ml.L-1的CO2加温和平衡.
, 百拇医药
3 讨论
培养成熟的心肌细胞难度较大，除了要求得到很好的急性分离的细胞外，还需要细胞培养的无菌环境. 既往研究表明，不同标本来源的心肌细胞以不同方式适应培养环境，其中有一些在培养基中会更快地发生形态学改变. 鼠、豚鼠、猫和兔是心肌细胞培养的最普遍应用的标本，可根据每种标本的冠脉灌流率和所摸索的最佳酶灌流次数，对溶液量进行调整，用相似的方法分离各种动物的心肌细胞[1]. 分离出的心肌细胞数量是一个重要的因素. 心肌细胞向培养基表面的吸附会影响细胞形态[3]. 与培养基表面的相互作用可能会改变其他特性，如膜电流和收缩性. 应用最为广泛的吸附因子是层粘连蛋白[1,2]，Ⅳ型胶原对成熟心肌细胞吸附同样有效，而Ⅰ型和Ⅲ型胶原作用较差. 所有用于心肌细胞培养的分离技术都是使用低Ca2+溶液去破坏细胞间连接，再通过酶消化分解细胞外基质，最后机械搅动分离出单个细胞. 因而，酶的选用至关重要. 我们介绍的方法既充分考虑到细胞培养的特殊要求，又充分利用成熟心肌细胞的较为成熟的分离技术，并使之结合，解决了成熟心肌细胞培养的技术难题.
, 百拇医药
作者简介：李予荣(1959-)，女(汉族)，四川省成都市人. 实验师. Tel.(029)3374876
参考文献：
[1] 商立军, 臧益民, 王四旺. 各部位心肌细胞的分离技术[J]. 心功能杂志, 1999; 12(3):182-184
[2] Ellingsen O, Davidoff AJ, Prasad SK et al. Adult rat ventricular myocytes cultured in defined medium: phenotype and electromechanical function[J]. Am J Physiol Heart Circ Phsiol, 1993; 265:H747-H754.
[3] Piper HM,Jacobson SL,Schwartz P. Determinants of cardiomyocyte development in longterm primary culture[J]. J Mol Cell Cardiol,1988;20:825-835.
收稿日期:2000-01-25
修回日期:2000-03-10, 百拇医药
单位：李予蓉(第四军医大学：预防医学系放射医学教研室， 陕西 西安 710033)；商立军(第四军医大学：基础部生理学教研室， 陕西 西安 710033)；范风云(第四军医大学：西京医院放射治疗科， 陕西 西安 710033)
关键词：成熟心肌细胞；分离；原代培养
第四军医大学学报000676 中图号：Q831.11 文献标识码：B
文章编号：1000-2790(2000)06-S0153-01
0 引言
我们介绍一种在无血清培养基中分离和培养成熟心肌细胞的方法[1,2]，着重强调对优化心肌细胞培养至关重要的分离过程.
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1 材料
分离装置可用典型的Langandorff装置，配合无菌操作要求，对心脏进行逆行灌注. 基本灌流液(溶液A)，是用纯水和高纯度试剂制备，其成分有(mmol.L-1)：NaCl 130; HEPES 23；葡萄糖21；牛磺酸20；肌酸5；MgCl2 5；丙酮酸钠5；KCl 4.5；NaH2PO4 1；pH7.3. 过滤(0.2 μm滤纸片)溶液除去微生物和水颗粒. A溶液是分离过程中使用的其他4种溶液的原料：①750 μmol.L-1 Ca2+溶液(300 mL A溶液+750 μmol.L-1 Ca2+); ②游离Ca2++EGTA溶液(300 mL A溶液+3.3 μmol.L-1 EGTA); ③酶溶液(80 mL A溶液+100 μmol.L-1 Ca2+, 1 g.L-1天然胶原酶和0.1 g.L-1蛋白酶); ④“酶洗脱”液(220 mL A溶液+100 μmol.L-1 Ca2+). 常规用来培养成熟心脏细胞的基础的、非补充培养基是碳酸氢盐缓冲培养基 199. 一般补充成分有(mmol.L-1)：肌酸5；牛磺酸5；L-肉毒碱2；丙酮酸2.5；胰岛素0.1 μmol.L-1. 为防止细菌感染，所有介质均含有青霉素50 U和链霉素50 mg.L-1. 细胞保存于恒温箱无菌环境中，50 mL.L-1 CO2～950 mL.L-1空气的气体环境中37℃. 吸附底物预处理培养基表面 可使用塑料或玻璃. 玻璃盖片在使用前用700 mL.L-1乙醇清洗，水冲洗并自动吸附. 有人提出用硝酸蚀刻玻璃以达到最佳吸附效果，但这不是必需的. 层粘连蛋白最终要在一定量磷酸盐缓冲盐水或培养基中稀释至15 mg.L-1的浓度. 这些盐水和培养基需足以覆盖培养物表面. 层粘连蛋白在铺开细胞前至少30 min就会吸附到培养皿上.
, 百拇医药
2 方法
脱颈处死动物，无菌条件下打开胸腔，取出心脏，在冰冷的(4℃) 750 μmol.L-1 Ca2+溶液中轻轻挤压心脏几次，以除去冠状血管中的血液. 将主动脉系在套管上，并用750 μmol.L-1Ca2+溶液灌注心脏. 2 min后转用无Ca2+的EGTA溶液灌流5 min. 用酶溶液灌注心脏8～14 min，当酶开始分解消化心脏时，流出心脏的液体变的越来越粘稠，并被收集进行再循环. 酶消化到最后，用100 μmol.L-1 Ca2+溶液洗5 min，将酶溶液洗出. 然后将心脏割离套管，割去心房和主动脉. 在灭菌的皮氏培养皿上，用小剪刀剪碎心室组织，将组织旋转在振摇烧瓶中，浸于50 mL 100 μmol.L-1 Ca2+溶液中，并在37℃下轻轻摇动以机械性分离心肌细胞. 同时给被消化组织充氧，充氧亦应温和. 振荡5～10 min后，过滤心肌细胞. 50 g离心1 min后，先用500 μmol.L-1 Ca2+溶液置换上清液，再用1 mol.L-1 Ca2+溶液置换. 温和的离心过程丢弃了大多数非心肌细胞、死亡细胞或高度收缩的心肌细胞. 有些实验室发现，用40 mL.L-1牛血清白蛋白离心或进行密度梯度离心，可进一步增加柱形心肌细胞的含量. 最后，细胞在培养基中再次悬浮并铺开[2]. 为了将心肌细胞以合适的密度铺开，可在4 mol.L-1 Ca2+溶液中用血细胞计数器对一小样本进行计数. 合适数目的细胞进行离心，而后在培养基的整个容积范围内再次悬浮，该培养基应足以覆盖培养物表面，心肌细胞可以按104.cm-2柱形细胞的密度铺开. 一旦心肌细胞被铺开，则将其放置4 h完成吸附. 这段时间过后轻轻更换介质，除去所有未吸附的细胞。培养的心肌细胞对切应力和介质骚动很敏感，因此介质更换必须缓慢而小心. 第1次介质更换后，每隔3 d更换1次，介质需要预先用50 ml.L-1的CO2加温和平衡.
, 百拇医药
3 讨论
培养成熟的心肌细胞难度较大，除了要求得到很好的急性分离的细胞外，还需要细胞培养的无菌环境. 既往研究表明，不同标本来源的心肌细胞以不同方式适应培养环境，其中有一些在培养基中会更快地发生形态学改变. 鼠、豚鼠、猫和兔是心肌细胞培养的最普遍应用的标本，可根据每种标本的冠脉灌流率和所摸索的最佳酶灌流次数，对溶液量进行调整，用相似的方法分离各种动物的心肌细胞[1]. 分离出的心肌细胞数量是一个重要的因素. 心肌细胞向培养基表面的吸附会影响细胞形态[3]. 与培养基表面的相互作用可能会改变其他特性，如膜电流和收缩性. 应用最为广泛的吸附因子是层粘连蛋白[1,2]，Ⅳ型胶原对成熟心肌细胞吸附同样有效，而Ⅰ型和Ⅲ型胶原作用较差. 所有用于心肌细胞培养的分离技术都是使用低Ca2+溶液去破坏细胞间连接，再通过酶消化分解细胞外基质，最后机械搅动分离出单个细胞. 因而，酶的选用至关重要. 我们介绍的方法既充分考虑到细胞培养的特殊要求，又充分利用成熟心肌细胞的较为成熟的分离技术，并使之结合，解决了成熟心肌细胞培养的技术难题.
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作者简介：李予荣(1959-)，女(汉族)，四川省成都市人. 实验师. Tel.(029)3374876
参考文献：
[1] 商立军, 臧益民, 王四旺. 各部位心肌细胞的分离技术[J]. 心功能杂志, 1999; 12(3):182-184
[2] Ellingsen O, Davidoff AJ, Prasad SK et al. Adult rat ventricular myocytes cultured in defined medium: phenotype and electromechanical function[J]. Am J Physiol Heart Circ Phsiol, 1993; 265:H747-H754.
[3] Piper HM,Jacobson SL,Schwartz P. Determinants of cardiomyocyte development in longterm primary culture[J]. J Mol Cell Cardiol,1988;20:825-835.
收稿日期:2000-01-25
修回日期:2000-03-10, 百拇医药