用ND-O-BSA-ELISA检测小鼠血清中抗麻风杆菌IgM抗体的研究
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37c医学网
作者：王荷英 张伟云 吴勤学 施美琴 王红春 陈祥生 花菊香
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：ND-O-BSA-ELISA分支杆菌；麻风血清学
中华皮肤科杂志990309
【摘要】目的 为了探讨感染麻风杆菌小鼠血清中特异性IgM抗体的变化情况。方法 用ND-O-BSA-ELISA检测了50只未感染小鼠及127只感染小鼠的IgM抗体水平。结果感染小鼠血清中IgM抗体水平非常显著地高于未感染正常小鼠(P<0.01)；未治疗组小鼠与治疗组小鼠间差异也有非常显著性(P<0.01)；而且不同抗麻风药物及同一药物不同剂量组之间抗体水平也出现明显差异(P<0.01或P<0.05)。结论感染小鼠IgM抗体水平与菌负荷一致，并与感染程度和实际化疗结果相关。
, 百拇医药
Study on Detecton of IgM Antibody Against Mycobacterium Leprae in Murine Sera with ND-O-BSA ELISA
WANG Heying, ZHANG Weiyun, WU Qingxue,et al.
Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Nanjing 210042
【 Abstract】 Objective To reveal the variation of specific IgM type antibodies in the mice infected by M.leprae. Methods The serum level of IgM antibody against M.leprae from 50 normal mice and 127 mice infected with M.leprae were detected with ND O BSA ELISA. Results The serum level of IgM antibody against M.leprae in infected mice was significantly higher than that in normal mice(P<0.01).There were significant differences between untreated group of mice and treated group of mice (P< 0.01) between different drug treated groups (P< 0.01), and between different dosage groups in the same drug treated mice (P< 0.01 or P< 0.05). Conclusion The serum level of IgM antibody against M.leprae in infected mice is consistent with bacterial load and related to the severity of infection and the therapeutical effects.
, 百拇医药
【 Key words】 ND-O-BSA-ELISA Mycobacterium,leprae Serology
80年代初以来，麻风血清学诊断的研究工作有了很大的发展，其中酶联免疫吸附试验(ELISA)因其特异性、敏感性高，又简易、快速，被广泛用于麻风病的防治研究[1]。近年，在感染麻风杆菌的犰狳和黑长尾猴等动物血清中，也发现存在麻风特异性抗体，此抗体与感染程度、治疗效果及流行情况等相关[2，3]。我们用NDOBSA(人工合成的麻风杆菌特异抗原酚糖脂的二糖表位)-ELISA检测感染麻风杆菌的小鼠血清中IgM抗体，并同未感染的正常小鼠作了比较。
材料和方法
一、小鼠血清来源
(一)正常小鼠血清：50只CFW系小鼠，摘眼球采血，制备成血清标本。
, http://www.100md.com (二)感染小鼠血清：127只CFW系小鼠，足垫感染麻风杆菌6～10个月后剖杀，死前用上述方法制成感染小鼠血清标本。感染动物中包括未治疗的对照组、利福平(RFP)、氨苯砜(DDS)不同剂量治疗组以及几种不同药物联合化疗组小鼠。
二、抗原
ND-O-BSA抗原由美国Colorado州立大学Brennan提供。用挥发性缓冲液将抗原配成浓度为0.1μg/mL，按每孔0.1mL包被于聚苯乙烯微量滴板，37℃18h干燥，置4℃备用。
三、酶结合物
羊抗鼠HRP-IgM购于Sigma公司。
四、ELISA方法
间接酶联免疫吸附试验。用PBS(pH7.2)将抗原包被板浸泡20min，再洗3次。每孔加200μL5%SMPBS，37℃保温2h后甩干。再加受检血清(用2.5%SMPBS按1∶100稀释)每孔100μL，37℃保温1h，甩去血清，用PBS冲洗3次，甩干。每孔加100μL酶结合物(用2.5%SMPBS作1∶1000稀释)。37℃保温1h，甩去酶结合物，用PBS冲洗3次，甩干。再加底物与显色剂(邻苯二胺-H2O2)，每孔100μL，37℃保温0.5h，然后加2.5NH2SO4，每孔50μL，中止反应，立即在波长490nm处用DG3022酶联免疫检测仪记录A值(曾称OD值)。每份标本做两孔，取平均值作终结果，实验设空白及阳性、阴性对照。
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结果
将50份正常小鼠血清的A值(0.0110±0.0106)与127份感染小鼠血清的A值(0.0456±0.0371)进行统计学分析，结果显示，这两组之间差异有非常显著性(t=6.48,P<0.01)。127只感染鼠在取血的同时作了足垫麻风杆菌计数，并以此为依据将感染鼠血清分为无菌组及有菌组。将无菌组与有菌组血清A值进行统计学分析，结果表明两组之间差异有非常显著性(t=3.05,P<0.01)。正常鼠、无菌组及有菌组血清IgM抗体水平比较结果见表1。从表1结果可知，从正常小鼠→无菌组→有菌组，其平均值逐渐上升。提示在无菌组中可能在足垫中有麻风杆菌，只是由于低于最低检出率(2.49×104)而未能检出，以及小鼠血清IgM抗体水平与菌负荷相关。感染小鼠中，有一部分是经DDS、RFP实验化疗的小鼠，这些小鼠经治疗后，足垫中均未找到麻风杆菌，将检测血清IgM的A值分别与同期对照组的A值相比较，其结果见表2、3。
表2的统计结果表明，0.0001%DDS组与对照组差异无显著性，而0.001%DDS组与对照组差异有非常显著性，且两个治疗组之间差异也有非常显著性(t=3.34,P<0.01)。由此可见，小鼠接受抗麻风药物剂量不同，也直接影响了小鼠血清中的抗体水平。表3统计学分析表明，RFP2.5mg/kg组与5.0mg/kg组分别与对照组比较，差异皆无显著性。而10.0mg/kg组与对照组比较差异则有非常显著性，表明用RFP治疗的小鼠血清中IgM抗体有明显变化，但仅在RFP高剂量组与对照组之间小鼠抗体水平有明显差异，RFP低剂量组IgM抗体水平未见明显下降。
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表1正常鼠、无麻风杆菌及有麻风杆菌小鼠血清中IgM抗体水平(A值的比较)
分组
受检血清数
IgM(M±s)
t值*
P值
正常小鼠
50
0.0110±0.0106
-
-
感染小鼠
, 百拇医药
有菌
40
0.0587±0.0415
7.82
<0.01
无菌
87
0.0370±0.0352
5.09
<0.01
*感染组(无菌和有菌)小鼠与正常小鼠比较
表2不同剂量氨苯砜治疗后小鼠血清中IgM抗体水平(A值)比较(M±s)
, 百拇医药
分组
受检血清数
IgM
t值*
P值
对照组
8
0.0606±0.0226
-
-
0.0001%氨苯砜
9
0.0678±0.0326
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0.52
>0.05
0.001%氨苯砜
10
0.0220±0.0272
3.22
<0.01
*与对照组比较
表3不同剂量利福平治疗后小鼠血清IgM抗体水平(A值)的比较(M±s)
分组
受检血清数
IgM
, 百拇医药
t值*
P值
对照组
8
0.0606±0.0226
-
-
2.5mg/kg利福平
10
0.0505±0.0290
0.81
>0.05
5.0mg/kg利福平
, 百拇医药
11
0.0482±0.0387
0.81
>0.05
10.0mg/kg利福平
6
0.0067±0.0140
5.12
<0.01
*治疗组与对照组比较
讨论
ND-O-BSA抗原是世界卫生组织推荐应用的一种半合成抗原，它不仅保存了PGL1的血清学特异性，而且易溶于水，比非极性分子的天然PGL1更适用于免疫学诊断。经6种抗原比较结果证明，ND-O-BSA抗原的交叉反应最小，最有实用价值[4，5]。通过麻风临床及实验麻风动物模型的研究资料表明：在麻风患者及感染麻风杆菌的犰狳和黑长尾猴的血清中，IgM抗体比IgG和IgA更有规律，并与疾病严重程度明显相关，即由TT→LL型麻风，IgM抗体水平逐渐升高。鉴于ND-O-BSA抗原具有上述优点，因此，本项研究选用了ND-O-BSA-ELISA法检查小鼠血清中IgM抗体以了解感染小鼠抗体水平的变化情况，而此项工作迄今尚未见报道。Truman报道[2]，感染麻风杆菌犰狳的血清中IgM抗体水平和耳组织病理学检查结果表明，与地方性动物麻风流行率密切相关。通过对50份未感染小鼠及127份感染麻风杆菌小鼠血清中IgM抗体的检测，证明小鼠同犰狳及黑长尾猴一样，血清中存在麻风特异性抗体。而且，感染小鼠同未感染小鼠比较，抗体水平差异非常显著。这表明免疫正常小鼠在接种麻风杆菌后，随着麻风杆菌出现繁殖，体内释放抗原，刺激体液免疫系统而产生一定量抗体，使血清中抗体水平升高。
, 百拇医药
许多资料表明，IgM抗体水平与麻风患者及动物体内菌负荷一致[3，5]，而在正常供血者血清中未检出IgM抗体。本项研究的实验结果也表明与此类同。本项研究的实验结果表明，未经治疗的感染小鼠及虽经治疗但疗效较差的小鼠，其血清中IgM抗体水平非常显著地高于经过治疗而疗效明显的小鼠，并与足垫中菌的负荷量相一致，这与其他实验麻风模型的血清学检查有类似现象。Gormus等[6]发现黑长尾猴患有麻风后，给予抗麻风药物治疗，治疗后4～11个月抗体水平呈现下降。本实验结果表明，感染小鼠对不同的抗麻风药物，同一药物不同剂量的效应不同，高剂量组小鼠抑制和杀灭麻风杆菌的能力比低剂量组小鼠强。因此，在小鼠足垫中麻风杆菌的增殖情况有差异，血清中IgM抗体水平也受到明显影响。上述结果提示，对感染麻风杆菌小鼠IgM抗体的检测，有助于评价小鼠在麻风实验化疗中受试药物的抗麻风杆菌活性。
参考文献
1 Chanteau S, Cartel JL, Celerier P,et al. PGL Ⅰ antigen and antibody detection in leprosy patients: evolution under chemotherapy. Int J Lepr, 1989,57:735- 743.
, http://www.100md.com
2 Truman RW. Job CK, Hastings RC, et al. Antibodies to the phenolic glycolipid Ⅰ antigen for epidemiologic investigations of enzootic leprosy in armadillos (Dasypus novemcinctus). Lepr Rev, 1990,61:19- 24.
3 Job CK, Drain V, Truman RW, et al. Early infection with M.leprae and antibodes to phenolic glycolipid Ⅰ in the nine hended armadillo. Indian J Lepr, 1990,62:193- 201.
4 Wu Q, Ye G, Li X, et al. Serological activity of natural disaceharide octyl bovine serum albumin (ND O BSA) in sera from patients with leprosy, tuberculosis and normal controls. Int J Lepr, 1988,56:50- 55.
5 吴勤学，李新宇，叶干运.对天然和人工抗原在麻风血清学诊断的评价.中国麻风杂志,1989,5:132-139.
6 Gormus BJ, Xu K, Cho SN, et al. Experimental leprosy in monkey Ⅱ . longitudinal serological observations in sooty mangabey monkeys. Lepr Rev, 1995,66:105- 125.
(收稿：1998-05-06修回：1999-01-23), 百拇医药
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：ND-O-BSA-ELISA分支杆菌；麻风血清学
中华皮肤科杂志990309
【摘要】目的 为了探讨感染麻风杆菌小鼠血清中特异性IgM抗体的变化情况。方法 用ND-O-BSA-ELISA检测了50只未感染小鼠及127只感染小鼠的IgM抗体水平。结果感染小鼠血清中IgM抗体水平非常显著地高于未感染正常小鼠(P<0.01)；未治疗组小鼠与治疗组小鼠间差异也有非常显著性(P<0.01)；而且不同抗麻风药物及同一药物不同剂量组之间抗体水平也出现明显差异(P<0.01或P<0.05)。结论感染小鼠IgM抗体水平与菌负荷一致，并与感染程度和实际化疗结果相关。
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Study on Detecton of IgM Antibody Against Mycobacterium Leprae in Murine Sera with ND-O-BSA ELISA
WANG Heying, ZHANG Weiyun, WU Qingxue,et al.
Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Nanjing 210042
【 Abstract】 Objective To reveal the variation of specific IgM type antibodies in the mice infected by M.leprae. Methods The serum level of IgM antibody against M.leprae from 50 normal mice and 127 mice infected with M.leprae were detected with ND O BSA ELISA. Results The serum level of IgM antibody against M.leprae in infected mice was significantly higher than that in normal mice(P<0.01).There were significant differences between untreated group of mice and treated group of mice (P< 0.01) between different drug treated groups (P< 0.01), and between different dosage groups in the same drug treated mice (P< 0.01 or P< 0.05). Conclusion The serum level of IgM antibody against M.leprae in infected mice is consistent with bacterial load and related to the severity of infection and the therapeutical effects.
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【 Key words】 ND-O-BSA-ELISA Mycobacterium,leprae Serology
80年代初以来，麻风血清学诊断的研究工作有了很大的发展，其中酶联免疫吸附试验(ELISA)因其特异性、敏感性高，又简易、快速，被广泛用于麻风病的防治研究[1]。近年，在感染麻风杆菌的犰狳和黑长尾猴等动物血清中，也发现存在麻风特异性抗体，此抗体与感染程度、治疗效果及流行情况等相关[2，3]。我们用NDOBSA(人工合成的麻风杆菌特异抗原酚糖脂的二糖表位)-ELISA检测感染麻风杆菌的小鼠血清中IgM抗体，并同未感染的正常小鼠作了比较。
材料和方法
一、小鼠血清来源
(一)正常小鼠血清：50只CFW系小鼠，摘眼球采血，制备成血清标本。
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二、抗原
ND-O-BSA抗原由美国Colorado州立大学Brennan提供。用挥发性缓冲液将抗原配成浓度为0.1μg/mL，按每孔0.1mL包被于聚苯乙烯微量滴板，37℃18h干燥，置4℃备用。
三、酶结合物
羊抗鼠HRP-IgM购于Sigma公司。
四、ELISA方法
间接酶联免疫吸附试验。用PBS(pH7.2)将抗原包被板浸泡20min，再洗3次。每孔加200μL5%SMPBS，37℃保温2h后甩干。再加受检血清(用2.5%SMPBS按1∶100稀释)每孔100μL，37℃保温1h，甩去血清，用PBS冲洗3次，甩干。每孔加100μL酶结合物(用2.5%SMPBS作1∶1000稀释)。37℃保温1h，甩去酶结合物，用PBS冲洗3次，甩干。再加底物与显色剂(邻苯二胺-H2O2)，每孔100μL，37℃保温0.5h，然后加2.5NH2SO4，每孔50μL，中止反应，立即在波长490nm处用DG3022酶联免疫检测仪记录A值(曾称OD值)。每份标本做两孔，取平均值作终结果，实验设空白及阳性、阴性对照。
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结果
将50份正常小鼠血清的A值(0.0110±0.0106)与127份感染小鼠血清的A值(0.0456±0.0371)进行统计学分析，结果显示，这两组之间差异有非常显著性(t=6.48,P<0.01)。127只感染鼠在取血的同时作了足垫麻风杆菌计数，并以此为依据将感染鼠血清分为无菌组及有菌组。将无菌组与有菌组血清A值进行统计学分析，结果表明两组之间差异有非常显著性(t=3.05,P<0.01)。正常鼠、无菌组及有菌组血清IgM抗体水平比较结果见表1。从表1结果可知，从正常小鼠→无菌组→有菌组，其平均值逐渐上升。提示在无菌组中可能在足垫中有麻风杆菌，只是由于低于最低检出率(2.49×104)而未能检出，以及小鼠血清IgM抗体水平与菌负荷相关。感染小鼠中，有一部分是经DDS、RFP实验化疗的小鼠，这些小鼠经治疗后，足垫中均未找到麻风杆菌，将检测血清IgM的A值分别与同期对照组的A值相比较，其结果见表2、3。
表2的统计结果表明，0.0001%DDS组与对照组差异无显著性，而0.001%DDS组与对照组差异有非常显著性，且两个治疗组之间差异也有非常显著性(t=3.34,P<0.01)。由此可见，小鼠接受抗麻风药物剂量不同，也直接影响了小鼠血清中的抗体水平。表3统计学分析表明，RFP2.5mg/kg组与5.0mg/kg组分别与对照组比较，差异皆无显著性。而10.0mg/kg组与对照组比较差异则有非常显著性，表明用RFP治疗的小鼠血清中IgM抗体有明显变化，但仅在RFP高剂量组与对照组之间小鼠抗体水平有明显差异，RFP低剂量组IgM抗体水平未见明显下降。
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表1正常鼠、无麻风杆菌及有麻风杆菌小鼠血清中IgM抗体水平(A值的比较)
分组
受检血清数
IgM(M±s)
t值*
P值
正常小鼠
50
0.0110±0.0106
-
-
感染小鼠
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有菌
40
0.0587±0.0415
7.82
<0.01
无菌
87
0.0370±0.0352
5.09
<0.01
*感染组(无菌和有菌)小鼠与正常小鼠比较
表2不同剂量氨苯砜治疗后小鼠血清中IgM抗体水平(A值)比较(M±s)
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分组
受检血清数
IgM
t值*
P值
对照组
8
0.0606±0.0226
-
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0.0001%氨苯砜
9
0.0678±0.0326
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0.52
>0.05
0.001%氨苯砜
10
0.0220±0.0272
3.22
<0.01
*与对照组比较
表3不同剂量利福平治疗后小鼠血清IgM抗体水平(A值)的比较(M±s)
分组
受检血清数
IgM
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t值*
P值
对照组
8
0.0606±0.0226
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2.5mg/kg利福平
10
0.0505±0.0290
0.81
>0.05
5.0mg/kg利福平
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0.0482±0.0387
0.81
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10.0mg/kg利福平
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0.0067±0.0140
5.12
<0.01
*治疗组与对照组比较
讨论
ND-O-BSA抗原是世界卫生组织推荐应用的一种半合成抗原，它不仅保存了PGL1的血清学特异性，而且易溶于水，比非极性分子的天然PGL1更适用于免疫学诊断。经6种抗原比较结果证明，ND-O-BSA抗原的交叉反应最小，最有实用价值[4，5]。通过麻风临床及实验麻风动物模型的研究资料表明：在麻风患者及感染麻风杆菌的犰狳和黑长尾猴的血清中，IgM抗体比IgG和IgA更有规律，并与疾病严重程度明显相关，即由TT→LL型麻风，IgM抗体水平逐渐升高。鉴于ND-O-BSA抗原具有上述优点，因此，本项研究选用了ND-O-BSA-ELISA法检查小鼠血清中IgM抗体以了解感染小鼠抗体水平的变化情况，而此项工作迄今尚未见报道。Truman报道[2]，感染麻风杆菌犰狳的血清中IgM抗体水平和耳组织病理学检查结果表明，与地方性动物麻风流行率密切相关。通过对50份未感染小鼠及127份感染麻风杆菌小鼠血清中IgM抗体的检测，证明小鼠同犰狳及黑长尾猴一样，血清中存在麻风特异性抗体。而且，感染小鼠同未感染小鼠比较，抗体水平差异非常显著。这表明免疫正常小鼠在接种麻风杆菌后，随着麻风杆菌出现繁殖，体内释放抗原，刺激体液免疫系统而产生一定量抗体，使血清中抗体水平升高。
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许多资料表明，IgM抗体水平与麻风患者及动物体内菌负荷一致[3，5]，而在正常供血者血清中未检出IgM抗体。本项研究的实验结果也表明与此类同。本项研究的实验结果表明，未经治疗的感染小鼠及虽经治疗但疗效较差的小鼠，其血清中IgM抗体水平非常显著地高于经过治疗而疗效明显的小鼠，并与足垫中菌的负荷量相一致，这与其他实验麻风模型的血清学检查有类似现象。Gormus等[6]发现黑长尾猴患有麻风后，给予抗麻风药物治疗，治疗后4～11个月抗体水平呈现下降。本实验结果表明，感染小鼠对不同的抗麻风药物，同一药物不同剂量的效应不同，高剂量组小鼠抑制和杀灭麻风杆菌的能力比低剂量组小鼠强。因此，在小鼠足垫中麻风杆菌的增殖情况有差异，血清中IgM抗体水平也受到明显影响。上述结果提示，对感染麻风杆菌小鼠IgM抗体的检测，有助于评价小鼠在麻风实验化疗中受试药物的抗麻风杆菌活性。
参考文献
1 Chanteau S, Cartel JL, Celerier P,et al. PGL Ⅰ antigen and antibody detection in leprosy patients: evolution under chemotherapy. Int J Lepr, 1989,57:735- 743.
, http://www.100md.com
2 Truman RW. Job CK, Hastings RC, et al. Antibodies to the phenolic glycolipid Ⅰ antigen for epidemiologic investigations of enzootic leprosy in armadillos (Dasypus novemcinctus). Lepr Rev, 1990,61:19- 24.
3 Job CK, Drain V, Truman RW, et al. Early infection with M.leprae and antibodes to phenolic glycolipid Ⅰ in the nine hended armadillo. Indian J Lepr, 1990,62:193- 201.
4 Wu Q, Ye G, Li X, et al. Serological activity of natural disaceharide octyl bovine serum albumin (ND O BSA) in sera from patients with leprosy, tuberculosis and normal controls. Int J Lepr, 1988,56:50- 55.
5 吴勤学，李新宇，叶干运.对天然和人工抗原在麻风血清学诊断的评价.中国麻风杂志,1989,5:132-139.
6 Gormus BJ, Xu K, Cho SN, et al. Experimental leprosy in monkey Ⅱ . longitudinal serological observations in sooty mangabey monkeys. Lepr Rev, 1995,66:105- 125.
(收稿：1998-05-06修回：1999-01-23), 百拇医药