孕酮和山莨菪碱对大鼠泌乳素瘤以及下丘脑多巴胺和去甲肾上腺素的影响
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作者：李江源 张建振 黄兆坚 汪寅章
单位：解放军总医院内分泌科，北京 100853
关键词：雌激素；垂体泌乳素瘤；大鼠
军医进修学院学报990408 摘要 目的：探讨用乙酚(DES)诱发Wistar大鼠垂体泌乳素(PRL)瘤形成的规律和发病机制，及山莨菪碱和孕酮的预防作用。方法：雌性Wistar大鼠切除卵巢后随机分为 4 组：①对照组(n＝10)：在项背部皮下植入空白植入子；②山莨菪碱组(n＝10)：皮下同时植入山莨菪碱 10 mg 和DES 20 mg 两种植入子；③孕酮组(n＝10)：皮下植入含 10 mg 孕酮和 20 mg DES两种植入子；④DES组(n＝25)：皮下植入含 20 mg DES植入子。分别于第 2 至第 10 周处死收集躯干血标本，分离血清测定PRL，同时摘除垂体前叶，分别做匀浆测定PRL及PRL免疫组化检查。切除下丘脑，匀浆测定多巴胺(DA)和去甲肾上腺素(NE)水平。结果：DES组大鼠的垂体重量以及垂体和血清PRL水平从第 2 周起显著升高(P<0.01 或<0.05)。DES组大鼠垂体PRL细胞在第 2 周和第 4 周呈现增生性改变，第 6 周部分呈腺瘤性改变，第 8 周和 10 周全部为腺瘤样改变。下丘脑的DA和NE浓度于第 4 周下降到最低点，和对照组大鼠比较差异非常显著(P均<0.01)。山莨菪碱组和孕酮组的各项指标和DES组比较差异无显著性意义(P均>0.05)。结论：①皮下植入DES可刺激Wistar大鼠垂体PRL细胞增生，在第 8 周全部大鼠垂体形成PRL瘤。②DES组大鼠下丘脑内DA和NE含量降低，提示下丘脑DA和NE神经元可能参与了垂体PRL分泌的调节。③孕酮对雌激素诱发垂体PRL瘤过程没有保护作用或这种作用太弱。④山莨菪碱对DES诱发大鼠垂体PRL瘤没有明显影响，提示胆碱能神经元可能不参与PRL分泌的调节。
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中国图书资料分类法分类号 R 736.4
Effects of progesterone and anisodamine on rat prolactinoma and hypothalamic levels of dopamine and epinephrine
Li Jiangyuan, Zhang Jianzhen, Huang Zhaojian, Wang Yunzheng
(Department of Endocrinology, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:To investigate the forming regularity and pathogenesis of DES-induced pituitary prolactinoma and the preventing effects of anisodamine and progesterone. Methods:Ovariectomized female Wistar rats were randomly divided into 4 groups: (1) Control group (n＝10): A blank implant was subcutaneously implanted over the neck; (2) Anisodamine group (n＝10): An implant contained 10 mg anisodamine and an implant with 20 mg DES were subcutaneously coimplanted; (3) Progesterone group (n＝10); 10 mg progesterone implant and 20 mg DES implant were co-implanted; (4) DES group (n＝25): 20 mg DES implant only. Five rats in DES group were executed in Week 2、 4、 6、 8 and 10 respectively, and 5 rats in the remaining 3 groups were executed in week 8 and 10 respectively. Trunk blood sample were collected for serum PRL measurement. The anterior pituitary gland and hypothalamus were extirpated for PRL immunocytochemical examination and dopamine (DA) and norepinephrine (NE) measurement. Results:The weight of pituitary gland and serum and pituitary PRL levels in rats of the DES group were significantly greater than those of control group (all P<0.01 or <0.05). Pituitary gland during week 2 and 4 presented lactotropic hyperplasia, and partial pituitary gland became prolactinoma in week 6, and all of them developed prolactinoma in week 8 and 10. The DA and NE concentrations in hypothalamus decreased to the nadir in week 4 and were significantly lower than those of control group (all P<0.01). All the parameters mentioned above in anisodamine group and progesterone group were not signifiantly different to DES group (all P>0.05). Conclusion:(1) Subcutaneous DES implantation is capable of stimulating the lactotrope hyperplasia and finally forming prolactinoma in Wistar rat; (2) The decrease of hypothalamic DAand NE concentrations in DES group suggestes that hypothalamic dopaminergic and noradrenergic neurons take part in the regulation of PRL secretion; (3) The effect of progesterone protecting lactotropes against DES-induced prolactinoma was not found; and (4) For no effect of amisodamine on preventing DES-induced pituitary prolactinoma, the hypothalamic cholinergic neurons seem not to joint the regulation of pituitary PRL secretion.
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Key words Estrogen; pituitary prolactinoma; rat
雌激素诱发的大鼠垂体泌乳素(PRL)瘤模型对研究PRL瘤形成的机制和寻求有效的治疗措施具有重要的意义。笔者用DES诱发大鼠垂体PRL瘤，通过对下丘脑内DA和NE水平测定，探讨PRL瘤的致病原因，并观察了孕酮和M-胆碱能受体阻滞剂山莨菪碱对雌激素诱发PRL瘤的防治作用。
1 材料和方法
1.1 动物分组和处理 成年雌性Wistar大鼠 (n＝55) 体重 120～150 g，腹腔内注射 0.15% 噻胺酮 (25 mg/kg) 麻醉，腹部常规消毒，正中切口，切除双侧卵巢。然后随机分为 4 组：① 对照组 (n＝10)：于项背部皮下植入空白植入子 (2 cm 长硅胶管，内径 1.57 mm，外径 2.41 mm)；② 山莨菪碱组 (n＝10)：同时皮下植入含 10 mg 山莨菪碱植入子和 20 mg DES植入子；③ 孕酮组 (n＝10)：同时植入 10 mg 孕酮植入子和 20 mg DES植入子；④ DES组 (n＝25)：皮下植入 20 mg DES植入子。DES组分别于 2 周、 4 周、 6 周、 8 周和 10 周各处死 5 只大鼠，其余各组分别在 8 周和 10 周各处死 5 只大鼠。DES和孕酮纯品购自北京向阳制药厂，山莨菪碱购自北京制药厂。
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大鼠断头处死时留取躯干血标本 1.5～2 ml，分离血清 -20 ℃ 保存。同时用咬骨钳打开颅盖，翻开大脑，摘下垂体，剔除后叶，观察垂体有无出血坏死。垂体前叶的一半进行组织学和免疫组化检查，另一半加入 1 ml 0.9% NaCl，用 5 ml 匀浆器人工匀浆，离心 10 000 r/min 20 min，保留上清进行PRL测定。以视交叉为前界，乳头体为后界，大脑半球的内侧缘为侧界和深度约 4 mm 的定界摘除下丘脑，重量在 85～115 mg 之间。
1.2 大鼠PRL放免测定 血清和垂体前叶PRL水平测定用美国NHPP提供的试剂盒，灵敏度为 1.75 ng/ml，批内和批间C.V.分别为 5.6% 和 9.2%。
1.3 下丘脑DA和NE测定 离体下丘脑加入 350 μl 含 0.5 mmol/L EDTA的冷 0.2 mmol/L 高氯酸溶液人工匀浆， 4 ℃ 离心 (10 000 r/min) 20 min，收集上清液。取 20 μl 上清液用高效液相色谱(beckman system gold USA.)-电化学检测仪(LC-4B, U.S.A.)测定DA和NE浓度，DA和NE的检测灵敏度分别为 0.7 ng/ml 和 2.0 ng/ml，批间C.V.分别为 2.0% 和 3.8%。流动相选用乙酰钠-柠檬酸缓冲液，pH为 3.7，流速为 0.8 ml/min，压力为 14.616 MPa。将标准品和内标定量混合作为标准品对照，比较样品与标准样品中相应物质的峰面积比，计算含量。标准品和内标由中科院基础所Beckman生命技术实验室提供，为Sigma产品，余试剂为北京化工厂产品，试剂纯。
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1.4 组织学和免疫组化检查 垂体前叶组织常规制成切片，HE染色，光镜观察组织学形态。一部分切片用LSAB法(美国ZyMED公司免疫组化试剂盒)进行免疫组织化检查，切片用 0.05% 胰蛋白酶温育后，加入山羊血清 20 min，倾弃血清加入抗PRL血清过夜，然后加入二抗， 37 ℃ 温育 40 min，加入辣根过氧化酶标记的链霉卵白素温育，然后DAB染色，抗鼠PRL血清稀释度为 1∶1 000。
1.5 统计学处理 测定值以
±s表示，组间比较采用t检验和F检查处理。
2 结 果
2.1 大鼠体重的变化 植入DES各组大鼠体重明显下降，和对照组比较有显著性意义(表 1)。
表 1 各组大鼠体重的变化(±s，W/g) 时间(周)
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对照组
山莨菪碱组
孕酮组
DES组
8
237±17
172±12△
182±12△
179±9**
10
258±15
146±15△
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179±14△
176±20**
**与对照组的比较P<0.01；△与DES组比较，P>0.05
2.2 血清PRL水平的变化 DES组的血清PRL水平从第 2 周开始显著升高，第 8 周达到高峰。山莨菪碱组和孕酮组与DES组比较，差异无显著性意义(表 2)。表 2 各组大鼠的血清PRL水平(±s，ρ/μg.L-1) 时间(周)
对照组
山莨菪碱组
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孕酮组
DES组
2
158.8±21.4*
4
379.0±51.7**
6
2131.6±1595.2**
8
67.4±19.6
2175.2±1436.4△
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2035.8±939.9△
3065.4±1327.8**
10
90.2±33.2
2037.8±1284.7△
2196.5±1406.6△
3015.8±1699.4**
**与对照组的比较P<0.01；△与DES组比较，P>0.05
2.3 全垂体重量和半垂体PRL含量的变化 从第 2 周开始，DES组的全垂体重量和半垂体PRL含量逐渐增加，与对照组比较差异非常显著；与山莨菪碱组和孕酮组比较，差异不显著(表 3)。表3 各组全垂体重量(mg)和半垂体PRL(μg/L)含量(±s) 时间
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(周)
对照组
山莨菪碱组
孕酮组
DES组
重量
PRL
重量
PRL
重量
PRL
重量
PRL
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2
19.1±2.7**
1.5±0.1**
4
29.9±3.4**
2.6±0.3**
6
66.0±20.9**
6.1±3.9**
8
13.8±0.8
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0.8±0.1
97.6±40.2△
7.5±1.3△
87.5±32.7△
7.0±1.5△
85.3±16.7**
7.0±0.6**
10
13.8±1.0
0.8±0.1
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104.2±42.9△
8.6±0.9△
86.0±25.4△
7.9±1.2△
97.3±58.6**
7.8±0.9**
**与对照组的比较P<0.01；△与DES组比较，P>0.05
2.4 垂体组织学改变和免疫组化检查 DES组 2～4 周的垂体标本肉眼观体积增大，颜色呈灰白色，与正常垂体颜色基本相同，光镜下细胞体积增大，数目增多，胞浆增多，胞核大小基本一致，核质染色不均匀，无核异型性。免疫组化染色发现泌乳素细胞较对照组显著增加，胞浆内PRL含量增多。 8～10 周垂体体积增大更明显，呈暗红色，组织较软，易碎，切面可见出血。光镜下细胞数目增多更明显，细胞呈圆形或多角形，胞浆带增宽，核大小不一，深染，有核异型性。免疫组化染色PRL阳性细胞充满视野，着色加深。 6 周时只有一部分大鼠垂体的细胞学改变和 8～10 周垂体相似。
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2.5 下丘脑DA和NE浓度的变化 DES组下丘脑DA和NE含量和对照组比较在第 2 周即显著降低，约在 4～6 周下降至低水平；与山莨菪碱组和孕酮组比较，差异不显著(表 4)。表 4 各组下脑DA和NE含量(±s，ng/g湿组织) 时间
(周)
对照组
山莨菪碱组
孕酮组
DES组
DA
NE
DA
, 百拇医药
NE
DA
NE
DA
NE
2
280.1±30.2**
1129.0±54.6**
4
99.3±15.0**
1047.3±141.7**
, 百拇医药 6
130.8±58.0**
993.5±211.2**
8
458.3±89.1
1313.0±168.2
120.1±21.5△
1078.7±134.4△
132.4±24.2△
1026.3±145.5△
, 百拇医药
112.1±18.8**
1004.6±155.3**
10
401.0±72.5
1383.5±131.1
107.7±30.2△
957.0±169.6△
157.5±21.5△
1029.7±59.8△
109.3±28.9**
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989.4±155.0**
**与对照组的比较P<0.01；△与DES组比较，P>0.05
3 讨 论
本实验结果表明，DES可以引起大鼠垂体泌乳素细胞增生，并最后形成腺瘤。随着DES作用时间的延长，垂体重量，垂体泌乳素细胞内和血清PRL水平逐渐增加，是垂体泌乳素细胞从增生到腺瘤形成的过程。增生和腺瘤的鉴别存在着不同的标准，有人认为增生只是细胞密度增大和胞浆增宽，而腺瘤形成时细胞密集排列，细胞形态不一，偶见核分裂相〔1〕。也有人认为垂体重量大于 50 mg 即可以判断为腺瘤〔2〕。综合上述两种标准进行判别，本实验 6 周时DES组约 40% 的大鼠已形成垂体泌乳素腺瘤， 8 周时 100% 的大鼠形成腺瘤，此时垂体的平均重量为 85 mg，最大重量为 113.6 mg。DES皮下植入子在体内连续释放出DES，对下丘脑-垂体产生强烈而持久的作用，这种给药方式对雌激素诱发大鼠垂体泌乳素瘤模型的建立起到了很好的效果，而腹腔给药方式则较差， 60 d 后垂体泌乳素瘤的发生率只有 25%〔1〕。不同品系大鼠对雌激素的敏感性不同，同样采取DES皮下植入的方法，F344 大鼠 30 天即可形成泌乳素瘤〔3〕，而Wistar大鼠需要 8 周。但是 F344 大鼠价格较高，在经费不足的情况下，Wistar大鼠仍不失为一种好的选择。
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此外，我们的实验亦证明皮下植入DES可以显著降低下丘脑的DA的含量，第 4 周时已降至最低点。在以后延续实验的 6 周时间内，DA浓度处于持续受抑制状态。DA很可能就是下丘脑释放的泌乳素抑制因子(PIF)，DA分泌量的减低，解除了垂体泌乳素细胞的被抑制状态，导致细胞增生和腺瘤形成。DA是下丘脑内的DA能神经元合成和分泌的，DA能神经元分布于弓状核、室旁核和背内侧核，以弓状核为主。这些神经元内含有雌激素受体，能与雌激素结合，使神经元变性，酪氨酸羟化酶活性降低〔4〕。垂体泌乳素细胞亦含有雌激素受体，雌激素亦可能直接作用于垂体，诱发高泌乳素血症，后者对下丘脑DA神经元发生了破坏作用〔5〕。DA能神经元缺乏β酪氨酸羟化酶活性，不能将DA转化为NE，下丘脑NE含量的变化可能是NE神经元发生了变化所致。我们发现DES可以引起下丘脑NE水平下降，是否NE亦参与了DES诱发垂体泌乳素瘤的过程，还需要进行深入的研究。
雌激素在体内代谢过程中，产生许多活性物质，如邻苯二酚雌激素、苯氧基雌激素以及自由基等，它们具有细胞毒作用，能引起细胞损伤、增殖或畸变，促发肝、肾、乳腺和子宫等器官肿瘤形成〔6〕，也可促进某些原癌基因的表达〔7〕。孕酮可使靶细胞内的雌激素受体数目减少，促进雌二醇降解为雌三醇〔8〕。因此，一般认为孕酮有保护机体拮抗雌激素的致肿瘤作用。但是在本实验中将孕酮和DES同时植入大鼠皮下，并没有显示孕酮有任何防止或减弱DES的致垂体泌乳素瘤作用。山莨菪碱也没有拮抗雌激素的作用，提示胆碱能神经元可能与PRL分泌的调节无关。
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参考文献
1 薛毅珑，段国升，张灿元.雌酮诱发大白鼠垂体腺瘤的动物模型.中华实验外科杂志，1992，9：136
2 Welsch CW, Jinklins T, Amenomori Y et al. Tumorous development of in situ and grafted anterior pituitary in female rats treated with diethylstibestrol. Experiment, 1971,27:1350
3 EL-Azouzi M, Hsu RW, Black PM et al. The importance of dopamine in the pathogenesis of experimental prolactinomas. J Neurosurg, 1990,72:273
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4 Mariann B, Bruce SM, James LR. Transcriptional analysis of tyrosine hydroxylase gene expression in the tuberoinfundibular dopaminergic neurons of rat arcuate nucleus after estrogen treatment. J Biol Chem, 1987,262:817
5 Sarrar DK, Gottschall PE, Meites J. Damage to hypothalamic dopaminergic neurons is associated with development of prolactin-secreting pituitary tumor. Science, 1982,218:684
6 Li JJ, Li SA. Estrogen carcinogenesis in hamster tissue: A critical riview. Endocr Rev, 1990,11:524
7 许荣辊，郭伟海，黄曼影等.17β-雌二醇诱发大鼠腺垂体催乳素形成及原癌基因c-myc的表达.基础医学与临床，1993，13：29
8 Clarke CL, Sutherland RT. Progesterone regulation of cell proliferation. Endocr Rev, 1990,1:266
(1999—02—09收稿，1999—04—15修回), 百拇医药
单位：解放军总医院内分泌科，北京 100853
关键词：雌激素；垂体泌乳素瘤；大鼠
军医进修学院学报990408 摘要 目的：探讨用乙酚(DES)诱发Wistar大鼠垂体泌乳素(PRL)瘤形成的规律和发病机制，及山莨菪碱和孕酮的预防作用。方法：雌性Wistar大鼠切除卵巢后随机分为 4 组：①对照组(n＝10)：在项背部皮下植入空白植入子；②山莨菪碱组(n＝10)：皮下同时植入山莨菪碱 10 mg 和DES 20 mg 两种植入子；③孕酮组(n＝10)：皮下植入含 10 mg 孕酮和 20 mg DES两种植入子；④DES组(n＝25)：皮下植入含 20 mg DES植入子。分别于第 2 至第 10 周处死收集躯干血标本，分离血清测定PRL，同时摘除垂体前叶，分别做匀浆测定PRL及PRL免疫组化检查。切除下丘脑，匀浆测定多巴胺(DA)和去甲肾上腺素(NE)水平。结果：DES组大鼠的垂体重量以及垂体和血清PRL水平从第 2 周起显著升高(P<0.01 或<0.05)。DES组大鼠垂体PRL细胞在第 2 周和第 4 周呈现增生性改变，第 6 周部分呈腺瘤性改变，第 8 周和 10 周全部为腺瘤样改变。下丘脑的DA和NE浓度于第 4 周下降到最低点，和对照组大鼠比较差异非常显著(P均<0.01)。山莨菪碱组和孕酮组的各项指标和DES组比较差异无显著性意义(P均>0.05)。结论：①皮下植入DES可刺激Wistar大鼠垂体PRL细胞增生，在第 8 周全部大鼠垂体形成PRL瘤。②DES组大鼠下丘脑内DA和NE含量降低，提示下丘脑DA和NE神经元可能参与了垂体PRL分泌的调节。③孕酮对雌激素诱发垂体PRL瘤过程没有保护作用或这种作用太弱。④山莨菪碱对DES诱发大鼠垂体PRL瘤没有明显影响，提示胆碱能神经元可能不参与PRL分泌的调节。
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中国图书资料分类法分类号 R 736.4
Effects of progesterone and anisodamine on rat prolactinoma and hypothalamic levels of dopamine and epinephrine
Li Jiangyuan, Zhang Jianzhen, Huang Zhaojian, Wang Yunzheng
(Department of Endocrinology, General Hospital of PLA, Beijing 100853)
Abstract Objective:To investigate the forming regularity and pathogenesis of DES-induced pituitary prolactinoma and the preventing effects of anisodamine and progesterone. Methods:Ovariectomized female Wistar rats were randomly divided into 4 groups: (1) Control group (n＝10): A blank implant was subcutaneously implanted over the neck; (2) Anisodamine group (n＝10): An implant contained 10 mg anisodamine and an implant with 20 mg DES were subcutaneously coimplanted; (3) Progesterone group (n＝10); 10 mg progesterone implant and 20 mg DES implant were co-implanted; (4) DES group (n＝25): 20 mg DES implant only. Five rats in DES group were executed in Week 2、 4、 6、 8 and 10 respectively, and 5 rats in the remaining 3 groups were executed in week 8 and 10 respectively. Trunk blood sample were collected for serum PRL measurement. The anterior pituitary gland and hypothalamus were extirpated for PRL immunocytochemical examination and dopamine (DA) and norepinephrine (NE) measurement. Results:The weight of pituitary gland and serum and pituitary PRL levels in rats of the DES group were significantly greater than those of control group (all P<0.01 or <0.05). Pituitary gland during week 2 and 4 presented lactotropic hyperplasia, and partial pituitary gland became prolactinoma in week 6, and all of them developed prolactinoma in week 8 and 10. The DA and NE concentrations in hypothalamus decreased to the nadir in week 4 and were significantly lower than those of control group (all P<0.01). All the parameters mentioned above in anisodamine group and progesterone group were not signifiantly different to DES group (all P>0.05). Conclusion:(1) Subcutaneous DES implantation is capable of stimulating the lactotrope hyperplasia and finally forming prolactinoma in Wistar rat; (2) The decrease of hypothalamic DAand NE concentrations in DES group suggestes that hypothalamic dopaminergic and noradrenergic neurons take part in the regulation of PRL secretion; (3) The effect of progesterone protecting lactotropes against DES-induced prolactinoma was not found; and (4) For no effect of amisodamine on preventing DES-induced pituitary prolactinoma, the hypothalamic cholinergic neurons seem not to joint the regulation of pituitary PRL secretion.
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雌激素诱发的大鼠垂体泌乳素(PRL)瘤模型对研究PRL瘤形成的机制和寻求有效的治疗措施具有重要的意义。笔者用DES诱发大鼠垂体PRL瘤，通过对下丘脑内DA和NE水平测定，探讨PRL瘤的致病原因，并观察了孕酮和M-胆碱能受体阻滞剂山莨菪碱对雌激素诱发PRL瘤的防治作用。
1 材料和方法
1.1 动物分组和处理 成年雌性Wistar大鼠 (n＝55) 体重 120～150 g，腹腔内注射 0.15% 噻胺酮 (25 mg/kg) 麻醉，腹部常规消毒，正中切口，切除双侧卵巢。然后随机分为 4 组：① 对照组 (n＝10)：于项背部皮下植入空白植入子 (2 cm 长硅胶管，内径 1.57 mm，外径 2.41 mm)；② 山莨菪碱组 (n＝10)：同时皮下植入含 10 mg 山莨菪碱植入子和 20 mg DES植入子；③ 孕酮组 (n＝10)：同时植入 10 mg 孕酮植入子和 20 mg DES植入子；④ DES组 (n＝25)：皮下植入 20 mg DES植入子。DES组分别于 2 周、 4 周、 6 周、 8 周和 10 周各处死 5 只大鼠，其余各组分别在 8 周和 10 周各处死 5 只大鼠。DES和孕酮纯品购自北京向阳制药厂，山莨菪碱购自北京制药厂。
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大鼠断头处死时留取躯干血标本 1.5～2 ml，分离血清 -20 ℃ 保存。同时用咬骨钳打开颅盖，翻开大脑，摘下垂体，剔除后叶，观察垂体有无出血坏死。垂体前叶的一半进行组织学和免疫组化检查，另一半加入 1 ml 0.9% NaCl，用 5 ml 匀浆器人工匀浆，离心 10 000 r/min 20 min，保留上清进行PRL测定。以视交叉为前界，乳头体为后界，大脑半球的内侧缘为侧界和深度约 4 mm 的定界摘除下丘脑，重量在 85～115 mg 之间。
1.2 大鼠PRL放免测定 血清和垂体前叶PRL水平测定用美国NHPP提供的试剂盒，灵敏度为 1.75 ng/ml，批内和批间C.V.分别为 5.6% 和 9.2%。
1.3 下丘脑DA和NE测定 离体下丘脑加入 350 μl 含 0.5 mmol/L EDTA的冷 0.2 mmol/L 高氯酸溶液人工匀浆， 4 ℃ 离心 (10 000 r/min) 20 min，收集上清液。取 20 μl 上清液用高效液相色谱(beckman system gold USA.)-电化学检测仪(LC-4B, U.S.A.)测定DA和NE浓度，DA和NE的检测灵敏度分别为 0.7 ng/ml 和 2.0 ng/ml，批间C.V.分别为 2.0% 和 3.8%。流动相选用乙酰钠-柠檬酸缓冲液，pH为 3.7，流速为 0.8 ml/min，压力为 14.616 MPa。将标准品和内标定量混合作为标准品对照，比较样品与标准样品中相应物质的峰面积比，计算含量。标准品和内标由中科院基础所Beckman生命技术实验室提供，为Sigma产品，余试剂为北京化工厂产品，试剂纯。
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1.4 组织学和免疫组化检查 垂体前叶组织常规制成切片，HE染色，光镜观察组织学形态。一部分切片用LSAB法(美国ZyMED公司免疫组化试剂盒)进行免疫组织化检查，切片用 0.05% 胰蛋白酶温育后，加入山羊血清 20 min，倾弃血清加入抗PRL血清过夜，然后加入二抗， 37 ℃ 温育 40 min，加入辣根过氧化酶标记的链霉卵白素温育，然后DAB染色，抗鼠PRL血清稀释度为 1∶1 000。
1.5 统计学处理 测定值以
±s表示，组间比较采用t检验和F检查处理。2 结 果
2.1 大鼠体重的变化 植入DES各组大鼠体重明显下降，和对照组比较有显著性意义(表 1)。
表 1 各组大鼠体重的变化(
±s，W/g) 时间(周), 百拇医药
对照组
山莨菪碱组
孕酮组
DES组
8
237±17
172±12△
182±12△
179±9**
10
258±15
146±15△
, http://www.100md.com
179±14△
176±20**
**与对照组的比较P<0.01；△与DES组比较，P>0.05
2.2 血清PRL水平的变化 DES组的血清PRL水平从第 2 周开始显著升高，第 8 周达到高峰。山莨菪碱组和孕酮组与DES组比较，差异无显著性意义(表 2)。表 2 各组大鼠的血清PRL水平(
±s，ρ/μg.L-1) 时间(周)对照组
山莨菪碱组
, http://www.100md.com
孕酮组
DES组
2
158.8±21.4*
4
379.0±51.7**
6
2131.6±1595.2**
8
67.4±19.6
2175.2±1436.4△
, http://www.100md.com
2035.8±939.9△
3065.4±1327.8**
10
90.2±33.2
2037.8±1284.7△
2196.5±1406.6△
3015.8±1699.4**
**与对照组的比较P<0.01；△与DES组比较，P>0.05
2.3 全垂体重量和半垂体PRL含量的变化 从第 2 周开始，DES组的全垂体重量和半垂体PRL含量逐渐增加，与对照组比较差异非常显著；与山莨菪碱组和孕酮组比较，差异不显著(表 3)。表3 各组全垂体重量(mg)和半垂体PRL(μg/L)含量(
±s) 时间, 百拇医药
(周)
对照组
山莨菪碱组
孕酮组
DES组
重量
PRL
重量
PRL
重量
PRL
重量
PRL
, http://www.100md.com
2
19.1±2.7**
1.5±0.1**
4
29.9±3.4**
2.6±0.3**
6
66.0±20.9**
6.1±3.9**
8
13.8±0.8
, http://www.100md.com
0.8±0.1
97.6±40.2△
7.5±1.3△
87.5±32.7△
7.0±1.5△
85.3±16.7**
7.0±0.6**
10
13.8±1.0
0.8±0.1
, http://www.100md.com
104.2±42.9△
8.6±0.9△
86.0±25.4△
7.9±1.2△
97.3±58.6**
7.8±0.9**
**与对照组的比较P<0.01；△与DES组比较，P>0.05
2.4 垂体组织学改变和免疫组化检查 DES组 2～4 周的垂体标本肉眼观体积增大，颜色呈灰白色，与正常垂体颜色基本相同，光镜下细胞体积增大，数目增多，胞浆增多，胞核大小基本一致，核质染色不均匀，无核异型性。免疫组化染色发现泌乳素细胞较对照组显著增加，胞浆内PRL含量增多。 8～10 周垂体体积增大更明显，呈暗红色，组织较软，易碎，切面可见出血。光镜下细胞数目增多更明显，细胞呈圆形或多角形，胞浆带增宽，核大小不一，深染，有核异型性。免疫组化染色PRL阳性细胞充满视野，着色加深。 6 周时只有一部分大鼠垂体的细胞学改变和 8～10 周垂体相似。
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2.5 下丘脑DA和NE浓度的变化 DES组下丘脑DA和NE含量和对照组比较在第 2 周即显著降低，约在 4～6 周下降至低水平；与山莨菪碱组和孕酮组比较，差异不显著(表 4)。表 4 各组下脑DA和NE含量(
±s，ng/g湿组织) 时间(周)
对照组
山莨菪碱组
孕酮组
DES组
DA
NE
DA
, 百拇医药
NE
DA
NE
DA
NE
2
280.1±30.2**
1129.0±54.6**
4
99.3±15.0**
1047.3±141.7**
, 百拇医药 6
130.8±58.0**
993.5±211.2**
8
458.3±89.1
1313.0±168.2
120.1±21.5△
1078.7±134.4△
132.4±24.2△
1026.3±145.5△
, 百拇医药
112.1±18.8**
1004.6±155.3**
10
401.0±72.5
1383.5±131.1
107.7±30.2△
957.0±169.6△
157.5±21.5△
1029.7±59.8△
109.3±28.9**
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989.4±155.0**
**与对照组的比较P<0.01；△与DES组比较，P>0.05
3 讨 论
本实验结果表明，DES可以引起大鼠垂体泌乳素细胞增生，并最后形成腺瘤。随着DES作用时间的延长，垂体重量，垂体泌乳素细胞内和血清PRL水平逐渐增加，是垂体泌乳素细胞从增生到腺瘤形成的过程。增生和腺瘤的鉴别存在着不同的标准，有人认为增生只是细胞密度增大和胞浆增宽，而腺瘤形成时细胞密集排列，细胞形态不一，偶见核分裂相〔1〕。也有人认为垂体重量大于 50 mg 即可以判断为腺瘤〔2〕。综合上述两种标准进行判别，本实验 6 周时DES组约 40% 的大鼠已形成垂体泌乳素腺瘤， 8 周时 100% 的大鼠形成腺瘤，此时垂体的平均重量为 85 mg，最大重量为 113.6 mg。DES皮下植入子在体内连续释放出DES，对下丘脑-垂体产生强烈而持久的作用，这种给药方式对雌激素诱发大鼠垂体泌乳素瘤模型的建立起到了很好的效果，而腹腔给药方式则较差， 60 d 后垂体泌乳素瘤的发生率只有 25%〔1〕。不同品系大鼠对雌激素的敏感性不同，同样采取DES皮下植入的方法，F344 大鼠 30 天即可形成泌乳素瘤〔3〕，而Wistar大鼠需要 8 周。但是 F344 大鼠价格较高，在经费不足的情况下，Wistar大鼠仍不失为一种好的选择。
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此外，我们的实验亦证明皮下植入DES可以显著降低下丘脑的DA的含量，第 4 周时已降至最低点。在以后延续实验的 6 周时间内，DA浓度处于持续受抑制状态。DA很可能就是下丘脑释放的泌乳素抑制因子(PIF)，DA分泌量的减低，解除了垂体泌乳素细胞的被抑制状态，导致细胞增生和腺瘤形成。DA是下丘脑内的DA能神经元合成和分泌的，DA能神经元分布于弓状核、室旁核和背内侧核，以弓状核为主。这些神经元内含有雌激素受体，能与雌激素结合，使神经元变性，酪氨酸羟化酶活性降低〔4〕。垂体泌乳素细胞亦含有雌激素受体，雌激素亦可能直接作用于垂体，诱发高泌乳素血症，后者对下丘脑DA神经元发生了破坏作用〔5〕。DA能神经元缺乏β酪氨酸羟化酶活性，不能将DA转化为NE，下丘脑NE含量的变化可能是NE神经元发生了变化所致。我们发现DES可以引起下丘脑NE水平下降，是否NE亦参与了DES诱发垂体泌乳素瘤的过程，还需要进行深入的研究。
雌激素在体内代谢过程中，产生许多活性物质，如邻苯二酚雌激素、苯氧基雌激素以及自由基等，它们具有细胞毒作用，能引起细胞损伤、增殖或畸变，促发肝、肾、乳腺和子宫等器官肿瘤形成〔6〕，也可促进某些原癌基因的表达〔7〕。孕酮可使靶细胞内的雌激素受体数目减少，促进雌二醇降解为雌三醇〔8〕。因此，一般认为孕酮有保护机体拮抗雌激素的致肿瘤作用。但是在本实验中将孕酮和DES同时植入大鼠皮下，并没有显示孕酮有任何防止或减弱DES的致垂体泌乳素瘤作用。山莨菪碱也没有拮抗雌激素的作用，提示胆碱能神经元可能与PRL分泌的调节无关。
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参考文献
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3 EL-Azouzi M, Hsu RW, Black PM et al. The importance of dopamine in the pathogenesis of experimental prolactinomas. J Neurosurg, 1990,72:273
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4 Mariann B, Bruce SM, James LR. Transcriptional analysis of tyrosine hydroxylase gene expression in the tuberoinfundibular dopaminergic neurons of rat arcuate nucleus after estrogen treatment. J Biol Chem, 1987,262:817
5 Sarrar DK, Gottschall PE, Meites J. Damage to hypothalamic dopaminergic neurons is associated with development of prolactin-secreting pituitary tumor. Science, 1982,218:684
6 Li JJ, Li SA. Estrogen carcinogenesis in hamster tissue: A critical riview. Endocr Rev, 1990,11:524
7 许荣辊，郭伟海，黄曼影等.17β-雌二醇诱发大鼠腺垂体催乳素形成及原癌基因c-myc的表达.基础医学与临床，1993，13：29
8 Clarke CL, Sutherland RT. Progesterone regulation of cell proliferation. Endocr Rev, 1990,1:266
(1999—02—09收稿，1999—04—15修回), 百拇医药