不同钙摄入量对大鼠氟牙症发生的影响
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作者：欧阳伟 李玉晶 刘佐民 董凤英
单位：欧阳伟 李玉晶 董凤英(北京口腔医院口腔医学研究所 100050)；刘佐民(北京药物检定所动物中心)
关键词：钙；显微镜检查；电子；扫描透射；动物；实验
中华口腔医学杂志000115 摘 要：目的 观察不同钙摄入量对大鼠氟牙症发生的影响。方法 分别用含低钙、中钙(即标准钙)、高钙量的饲料喂养大鼠并使其摄取0.1 mol/L NaF水，同时设对照组。2个月后处死动物，分别用氟离子电极、显微放射照相、扫描电子显微镜检测各组动物上中切牙釉质平均氟含量及矿化程度和结构。结果 随摄入钙量的增加，大鼠上中切牙釉质中的氟含量减少(P<0.01)，釉质平均吸光度值减低(P<0.01)，釉质矿化程度增加。结论 牙齿发育期摄钙量越多，牙齿氟中毒程度越轻；补钙是预防氟中毒，提高硬组织矿化程度的有效手段。
, 百拇医药
Effect caused by uptake of different levels of calcium to enamel fluorosis in rats
OUYANG Wei
(Research Institute of Stomatology,Beijing Stomatological Hospital,Beijing 100050,China
LI Yujing
LIU Zuomin
Abstract：Objective：To study the effects caused by uptake of different levels of calcium to dental fluorosis in rats.Methods：Weanling rats were raised on water containing 0.1 mol/L fluoride and food containing low,normal and high levels of calcium for 2 months.The concentration of fluoride in enamel was analysed by F-ion-selective electrode.The microradiographic examination and light-density analysis were performed.The enamel structure was examined under SEM.Results：The more calcium was ingested,the lower level of fluoride amount in enamel was observed(P<0.01).With increasing food calcium ingestion,the light density value was decreasing,and the level of enamel mineralization was increasing(P<0.01).Conclusions：With increasing food calcium ingestion during the development of teeth,the level of dental fluorosis is decreasing .The calcium supply is effective in protection from fluoride toxicity to a certain extent.
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Key words：Calcium；Microscopy,electron,scanning transmission；Animals,laboratory▲
慢性氟中毒是分布较广泛的一种地方性流行病。虽有研究表明机体补充VitA、D、E及钼、碘、硒、 氨基酸等均可减轻或对抗氟中毒[1-3]，但上述物质抗氟的可行性、作用机制和对人体的有害作用等尚缺少确切的研究报道。近年来，人们对钙的抗氟作用的研究与应用十分重视，但观点尚不统一。我们通过动物实验，观察钙对氟牙症发生的化学、病理学方面的影响及钙摄入水平与氟中毒程度之间的关系，并探讨了补钙抗氟中毒的效果及机制。
材料与方法
1.动物实验：选用80只刚断乳的健康雌性Wistar大鼠。随机分为4组，20只/组。由于大鼠对氟中毒的耐受远较人类为强，在参考前人经验基础上，3个组选取0.1 mol/L NaF水作为饮用水并分别给以低钙(含钙0.071%)、中钙、高钙(含钙6.61%)饲料作为实验组。一组给中钙饲料(含钙0.79%)，饮去离子水为正常对照组。2个月后处死动物，拔取上颌中切牙洗净备用。
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2.釉质氟含量测定：将每只大鼠的2个上颌中切牙作为一个样品，磨取釉质，灰化后用盐酸溶解，用氟离子电极分别测得每组10个样品的氟含量，行F检验进行组间比较[4]。
3.显微放射照片的图像分析：每组选取7只大鼠的上中切牙制备(140±20)μm厚度的纵向牙磨片，用CSM-2复合型软X线摄影装置在5 kV、3 mA、10 s条件下拍摄显微放射照片,多功能图像分析仪进行釉质吸光度测定，行F检验比较各组釉质矿化程度。
4.扫描电镜观察：选取每组大鼠的上中切牙制备釉质表面和剖面样品，喷金镀膜后行JSM-35C 扫描电子显微镜观察(电压25 kV，电流1×10-5A)。
结果
1.动物实验观察： 实验过程中，低钙组大鼠逐渐表现出精神状态较差，食欲减低，体重增加最少。2个月后，对照组大鼠上中切牙釉质发育正常，着色均匀，无斑点、缺损。其余3组动物牙呈现不同程度氟中毒表现。高钙组较轻，仅少数牙有隐约可见的着色不均，低钙组最重，较多白垩状斑点、斑块、混浊，且常见部分釉质剥脱，表面凹凸不平，形成缺损。
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2.釉质氟含量测定：随钙摄入量增加，各组样品釉质氟含量有明显降低的趋势(P<0.01，表1)。
表1 各组大鼠上中切牙釉质氟含量的比较(n=10) 组别
平均釉质氟含量(μg/mg，
)
P值
(1)正常对照
0.281 1±0.019 0
(1):(2)<0.01
(2)高钙
0.458 8±0.026 0
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(1):(3)<0.01
(3)中钙
3.452 8±0.349 2
(1):(4)<0.01
(4)低钙
7.763 7±0.805 9
(2):(3)<0.01
(2):(4)<0.01
(3):(4)<0.01
3.显微放射照片的图象分析：
(1)显微放射照片观察：①对照组：釉质全层阻射性强而均匀，表面光滑完整。②高钙组：釉质表面光滑，基本完整，表面下偶见局部阻射下降区。③中钙组：釉质表面可见小缺损，表面下有明显透射区且分布不均。④低钙组：釉质表面出现缺损，有的全层剥脱分离，釉面完整区表层下透射性明显增强。
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(2)釉质平均吸光度分析: 各组牙标本显微放射照片测得的釉质平均吸光度值随摄钙量的增多而减低(P< 0.01)， 即釉质矿化程度增加(表2)。表2 各组大鼠上中切牙釉质平均吸光度比较(n=7) 组别
釉质平均吸光度()
P值
(1)正常对照
0.109±0.062
(1):(2)<0.01
(2)高钙
0.299±0.086
(1):(3)<0.01
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(3)中钙
0.425±0.143
(1):(4)<0.01
(4)低钙
0.567±0.143
(2):(3)<0.05
(2):(4)<0.01
(3):(4)<0.05
4.釉质扫描电镜观察：①对照组(图1)：釉质表面光滑完整，呈排列规则的纵向条索样表现，剖面可见完整清晰、密集排列的釉柱，与牙长轴成角略小于90°，分布均匀一致。②高钙组(图2)：釉质表面近似于对照组。剖面可见表层下破坏区，其宽度小于整个釉质宽度的1/4，破坏区内隐约可分辨釉柱的结构， 表层完整性尚好。③中钙组(图3)：釉质表面近似对照组，但局部有小的缺损。 剖面可见表面下明显的破坏区，宽度约为整个釉质宽度的1/3， 破坏区内釉柱结构走形不清。④低钙组(图4)：釉质表面明显破坏，失去完整性及正常结构形态，可见大量凹陷和剥落,分布散乱无规则。剖面可见釉质表层不完整，表层下破坏严重,破坏区内无釉柱结构，组织疏松甚至丧失。
, 百拇医药
图1 正常对照组表层完整平滑，釉柱结构、走形清晰，釉牙本质界清晰(×200) 图2 高钙组，表层基本完整，表层下略有破坏(×200) 图3 中钙组 表层轻微缺损破坏，表层下明显破坏区且其中釉质结构不清(×200) 图4 低钙组，表层广泛缺损剥脱，散乱无规则，表层下破坏区明显，正常釉质结构消失(×200)
讨论
一般认为釉质含氟量是牙齿及全身氟中毒的重要指标。有研究显示: 摄入高氟的动物补钙后可显著减少骨氟含量，并防止了牙齿病变的发生[5]。 本研究发现机体摄入钙越多，釉质中氟含量越少。说明氟中毒程度与摄钙量有关，用补钙方式拮抗氟中毒， 减少骨、牙氟的积蓄有显著作用；同时，减少牙体组织含氟量，是补钙拮抗氟牙症的途径之一。
扫描电镜观察发现，低钙组呈现相对严重的釉质矿化不全的病变特征,而高钙组表层下破坏的范围比中钙组小得多。因吸光度值可代表物质的阻射程度，与矿化程度成反比。本研究用测定牙片釉质吸光度来反映釉质的矿化程度。结果表明，各组牙釉质矿化程度依次为对照组>高钙组 >中钙组>低钙组。综上所述，在高氟摄入的同时提高钙摄入可以拮抗氟的毒性作用，改善矿化程度。本研究结果在其他的研究中也得到直接或间接的证实。如一些动物实验显示了血浆钙水平和血浆中氟的清除是相反的关系[6]。 一些体外对牙胚培养的研究支持了钙可以对抗氟对牙齿硬组织发育作用的观点[7]。
, 百拇医药
近来一些学者针对补钙抗氟的机制提出一些看法， 结合本研究结果， 笔者认为钙对氟的拮抗可能是补充了Ca2+后，Ca2+在胃肠道或血液中与F-结合为难溶的CaF2，被消化代谢后排出体外；同时多量的钙也可能结合了微环境中的氟，使游离F-减少。由于氟离子对釉质发育过程的调节和釉基质蛋白水解过程均有干扰，故Ca2+的补充实质上保证了釉质矿化过程得以正常进行[8-10]。
本研究从几个方面证明了补钙有明显的抗氟中毒的作用。为补钙抗氟提供了实验依据，但动物实验补钙量与实际应用有一定差距，今后应进一步探讨人不同程度氟中毒补钙的适宜量，以建立既保证人体生理健康，又可有效拮抗氟中毒的补钙方法。
基金项目：北京市自然科学基金资助项目
参考文献：
, 百拇医药
[1]刘翠凤.维生素和铁剂对小白鼠氟吸收的影响.北京口腔医学,1994,2:164-16.
[2]姚政民.氟斑牙与饮水中氟，碘， 钼的关系.中华口腔医学杂志，1991，26:367-369.
[3]邓海，曾昭慧，徐增军,等.硒的抗氟作用研究.中国地方病学杂志，1996，10：65-67.
[4]刘昌汉,主编.地方性氟中毒防治指南.第1版.北京：人民卫生出版社,1988.187-188.
[5]王凤华,李广生.食饵低钙对牙齿氟中毒影响的实验研究.中国地方病学杂志，1993，12:329-331.
[6]Larsen MJ,Richards A,Fejerskov O.Effect of intraperitoneally injected fluoride on plasma calcium in suckling and adult rats.Calcif Tissue Int,1981,33:541-544.
, 百拇医药
[7]Woltgens JH,Lyaruu DM,Bronckers AL,et al.Biomineralization during early stages of the developing tooth in vitro with special reference to secretory stage of amelogenesis.Int J Dev Biol,1995,39:203-212.
[8]Aoba T,Moreno EC,Tanabe T,et al.Effects of fluoride on matrix proteins and their properties in rat secretory enamel.J Dent Res,1990,69:1248-1255.
[9]Bronckers AL,Bervoets TJ,Lyaruu DM,et al.Antagonism of fluoride toxicity by high levels of calcium but not of inorganic phosphate during secretory amelogenesis in the hamster tooth germ in vitro.Archs Oral Biol,1989,34:625-636.
[10]Overall CM,Limeback H .Identification and characterization of enamel proteinases isolated from developing enamel.Biochem J,1988,256:965-972.
收稿日期：1998-12-07, 百拇医药
单位：欧阳伟 李玉晶 董凤英(北京口腔医院口腔医学研究所 100050)；刘佐民(北京药物检定所动物中心)
关键词：钙；显微镜检查；电子；扫描透射；动物；实验
中华口腔医学杂志000115 摘 要：目的 观察不同钙摄入量对大鼠氟牙症发生的影响。方法 分别用含低钙、中钙(即标准钙)、高钙量的饲料喂养大鼠并使其摄取0.1 mol/L NaF水，同时设对照组。2个月后处死动物，分别用氟离子电极、显微放射照相、扫描电子显微镜检测各组动物上中切牙釉质平均氟含量及矿化程度和结构。结果 随摄入钙量的增加，大鼠上中切牙釉质中的氟含量减少(P<0.01)，釉质平均吸光度值减低(P<0.01)，釉质矿化程度增加。结论 牙齿发育期摄钙量越多，牙齿氟中毒程度越轻；补钙是预防氟中毒，提高硬组织矿化程度的有效手段。
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Effect caused by uptake of different levels of calcium to enamel fluorosis in rats
OUYANG Wei
(Research Institute of Stomatology,Beijing Stomatological Hospital,Beijing 100050,China
LI Yujing
LIU Zuomin
Abstract：Objective：To study the effects caused by uptake of different levels of calcium to dental fluorosis in rats.Methods：Weanling rats were raised on water containing 0.1 mol/L fluoride and food containing low,normal and high levels of calcium for 2 months.The concentration of fluoride in enamel was analysed by F-ion-selective electrode.The microradiographic examination and light-density analysis were performed.The enamel structure was examined under SEM.Results：The more calcium was ingested,the lower level of fluoride amount in enamel was observed(P<0.01).With increasing food calcium ingestion,the light density value was decreasing,and the level of enamel mineralization was increasing(P<0.01).Conclusions：With increasing food calcium ingestion during the development of teeth,the level of dental fluorosis is decreasing .The calcium supply is effective in protection from fluoride toxicity to a certain extent.
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Key words：Calcium；Microscopy,electron,scanning transmission；Animals,laboratory▲
慢性氟中毒是分布较广泛的一种地方性流行病。虽有研究表明机体补充VitA、D、E及钼、碘、硒、 氨基酸等均可减轻或对抗氟中毒[1-3]，但上述物质抗氟的可行性、作用机制和对人体的有害作用等尚缺少确切的研究报道。近年来，人们对钙的抗氟作用的研究与应用十分重视，但观点尚不统一。我们通过动物实验，观察钙对氟牙症发生的化学、病理学方面的影响及钙摄入水平与氟中毒程度之间的关系，并探讨了补钙抗氟中毒的效果及机制。
材料与方法
1.动物实验：选用80只刚断乳的健康雌性Wistar大鼠。随机分为4组，20只/组。由于大鼠对氟中毒的耐受远较人类为强，在参考前人经验基础上，3个组选取0.1 mol/L NaF水作为饮用水并分别给以低钙(含钙0.071%)、中钙、高钙(含钙6.61%)饲料作为实验组。一组给中钙饲料(含钙0.79%)，饮去离子水为正常对照组。2个月后处死动物，拔取上颌中切牙洗净备用。
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2.釉质氟含量测定：将每只大鼠的2个上颌中切牙作为一个样品，磨取釉质，灰化后用盐酸溶解，用氟离子电极分别测得每组10个样品的氟含量，行F检验进行组间比较[4]。
3.显微放射照片的图像分析：每组选取7只大鼠的上中切牙制备(140±20)μm厚度的纵向牙磨片，用CSM-2复合型软X线摄影装置在5 kV、3 mA、10 s条件下拍摄显微放射照片,多功能图像分析仪进行釉质吸光度测定，行F检验比较各组釉质矿化程度。
4.扫描电镜观察：选取每组大鼠的上中切牙制备釉质表面和剖面样品，喷金镀膜后行JSM-35C 扫描电子显微镜观察(电压25 kV，电流1×10-5A)。
结果
1.动物实验观察： 实验过程中，低钙组大鼠逐渐表现出精神状态较差，食欲减低，体重增加最少。2个月后，对照组大鼠上中切牙釉质发育正常，着色均匀，无斑点、缺损。其余3组动物牙呈现不同程度氟中毒表现。高钙组较轻，仅少数牙有隐约可见的着色不均，低钙组最重，较多白垩状斑点、斑块、混浊，且常见部分釉质剥脱，表面凹凸不平，形成缺损。
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2.釉质氟含量测定：随钙摄入量增加，各组样品釉质氟含量有明显降低的趋势(P<0.01，表1)。
表1 各组大鼠上中切牙釉质氟含量的比较(n=10) 组别
平均釉质氟含量(μg/mg，
)P值
(1)正常对照
0.281 1±0.019 0
(1):(2)<0.01
(2)高钙
0.458 8±0.026 0
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(1):(3)<0.01
(3)中钙
3.452 8±0.349 2
(1):(4)<0.01
(4)低钙
7.763 7±0.805 9
(2):(3)<0.01
(2):(4)<0.01
(3):(4)<0.01
3.显微放射照片的图象分析：
(1)显微放射照片观察：①对照组：釉质全层阻射性强而均匀，表面光滑完整。②高钙组：釉质表面光滑，基本完整，表面下偶见局部阻射下降区。③中钙组：釉质表面可见小缺损，表面下有明显透射区且分布不均。④低钙组：釉质表面出现缺损，有的全层剥脱分离，釉面完整区表层下透射性明显增强。
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(2)釉质平均吸光度分析: 各组牙标本显微放射照片测得的釉质平均吸光度值随摄钙量的增多而减低(P< 0.01)， 即釉质矿化程度增加(表2)。表2 各组大鼠上中切牙釉质平均吸光度比较(n=7) 组别
釉质平均吸光度(
)P值
(1)正常对照
0.109±0.062
(1):(2)<0.01
(2)高钙
0.299±0.086
(1):(3)<0.01
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(3)中钙
0.425±0.143
(1):(4)<0.01
(4)低钙
0.567±0.143
(2):(3)<0.05
(2):(4)<0.01
(3):(4)<0.05
4.釉质扫描电镜观察：①对照组(图1)：釉质表面光滑完整，呈排列规则的纵向条索样表现，剖面可见完整清晰、密集排列的釉柱，与牙长轴成角略小于90°，分布均匀一致。②高钙组(图2)：釉质表面近似于对照组。剖面可见表层下破坏区，其宽度小于整个釉质宽度的1/4，破坏区内隐约可分辨釉柱的结构， 表层完整性尚好。③中钙组(图3)：釉质表面近似对照组，但局部有小的缺损。 剖面可见表面下明显的破坏区，宽度约为整个釉质宽度的1/3， 破坏区内釉柱结构走形不清。④低钙组(图4)：釉质表面明显破坏，失去完整性及正常结构形态，可见大量凹陷和剥落,分布散乱无规则。剖面可见釉质表层不完整，表层下破坏严重,破坏区内无釉柱结构，组织疏松甚至丧失。
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图1 正常对照组表层完整平滑，釉柱结构、走形清晰，釉牙本质界清晰(×200) 图2 高钙组，表层基本完整，表层下略有破坏(×200) 图3 中钙组 表层轻微缺损破坏，表层下明显破坏区且其中釉质结构不清(×200) 图4 低钙组，表层广泛缺损剥脱，散乱无规则，表层下破坏区明显，正常釉质结构消失(×200)
讨论
一般认为釉质含氟量是牙齿及全身氟中毒的重要指标。有研究显示: 摄入高氟的动物补钙后可显著减少骨氟含量，并防止了牙齿病变的发生[5]。 本研究发现机体摄入钙越多，釉质中氟含量越少。说明氟中毒程度与摄钙量有关，用补钙方式拮抗氟中毒， 减少骨、牙氟的积蓄有显著作用；同时，减少牙体组织含氟量，是补钙拮抗氟牙症的途径之一。
扫描电镜观察发现，低钙组呈现相对严重的釉质矿化不全的病变特征,而高钙组表层下破坏的范围比中钙组小得多。因吸光度值可代表物质的阻射程度，与矿化程度成反比。本研究用测定牙片釉质吸光度来反映釉质的矿化程度。结果表明，各组牙釉质矿化程度依次为对照组>高钙组 >中钙组>低钙组。综上所述，在高氟摄入的同时提高钙摄入可以拮抗氟的毒性作用，改善矿化程度。本研究结果在其他的研究中也得到直接或间接的证实。如一些动物实验显示了血浆钙水平和血浆中氟的清除是相反的关系[6]。 一些体外对牙胚培养的研究支持了钙可以对抗氟对牙齿硬组织发育作用的观点[7]。
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近来一些学者针对补钙抗氟的机制提出一些看法， 结合本研究结果， 笔者认为钙对氟的拮抗可能是补充了Ca2+后，Ca2+在胃肠道或血液中与F-结合为难溶的CaF2，被消化代谢后排出体外；同时多量的钙也可能结合了微环境中的氟，使游离F-减少。由于氟离子对釉质发育过程的调节和釉基质蛋白水解过程均有干扰，故Ca2+的补充实质上保证了釉质矿化过程得以正常进行[8-10]。
本研究从几个方面证明了补钙有明显的抗氟中毒的作用。为补钙抗氟提供了实验依据，但动物实验补钙量与实际应用有一定差距，今后应进一步探讨人不同程度氟中毒补钙的适宜量，以建立既保证人体生理健康，又可有效拮抗氟中毒的补钙方法。
基金项目：北京市自然科学基金资助项目
参考文献：
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[1]刘翠凤.维生素和铁剂对小白鼠氟吸收的影响.北京口腔医学,1994,2:164-16.
[2]姚政民.氟斑牙与饮水中氟，碘， 钼的关系.中华口腔医学杂志，1991，26:367-369.
[3]邓海，曾昭慧，徐增军,等.硒的抗氟作用研究.中国地方病学杂志，1996，10：65-67.
[4]刘昌汉,主编.地方性氟中毒防治指南.第1版.北京：人民卫生出版社,1988.187-188.
[5]王凤华,李广生.食饵低钙对牙齿氟中毒影响的实验研究.中国地方病学杂志，1993，12:329-331.
[6]Larsen MJ,Richards A,Fejerskov O.Effect of intraperitoneally injected fluoride on plasma calcium in suckling and adult rats.Calcif Tissue Int,1981,33:541-544.
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[7]Woltgens JH,Lyaruu DM,Bronckers AL,et al.Biomineralization during early stages of the developing tooth in vitro with special reference to secretory stage of amelogenesis.Int J Dev Biol,1995,39:203-212.
[8]Aoba T,Moreno EC,Tanabe T,et al.Effects of fluoride on matrix proteins and their properties in rat secretory enamel.J Dent Res,1990,69:1248-1255.
[9]Bronckers AL,Bervoets TJ,Lyaruu DM,et al.Antagonism of fluoride toxicity by high levels of calcium but not of inorganic phosphate during secretory amelogenesis in the hamster tooth germ in vitro.Archs Oral Biol,1989,34:625-636.
[10]Overall CM,Limeback H .Identification and characterization of enamel proteinases isolated from developing enamel.Biochem J,1988,256:965-972.
收稿日期：1998-12-07, 百拇医药
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