蚕蚀性角膜溃疡患者外周血淋巴细胞免疫表型和T细胞活化的研究
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作者：谢汉平 陈家祺 杨培增 曾耀英 葛琪 狄静芳 冯铮 孙荭
单位：陈家祺 杨培增：中山医科大学中山眼科中心(广州 510060)；谢汉平：重庆第三军医大学附属第一医院眼科(重庆 400038)；曾耀英 葛琪 狄静芳 冯铮 孙荭：暨南大学组织移植免疫中心
关键词：角膜溃疡；免疫表型分型；淋巴细胞转化；流式细胞术
中国病理生理杂志991022 摘要 目的：观察蚕蚀性角膜溃疡患者外周血淋巴细胞免疫表型和T细胞活化的变化，进一步探讨本病患者的免疫功能。方法：用流式细胞术检测8例活动性蚕蚀性角膜溃疡患者外周血淋巴细胞30项免疫表型变化，用植物凝集素和沸波醇酯作为刺激剂，以HLA-DR，CD69、CD71、CD25的表达为T细胞活化的指标，用流式细胞术分析。结果：蚕蚀性角膜溃疡患者外周血CD4、CD5、CD8、CD10、CD11b、CD15、CD16、CD19、CD23、CD25、CD41、CD57、CD69、HLA-DP、HLA-DR抗原表达阳性淋巴细胞以及HLA-DR、CD69、CD71、CD25在CD3和CD8细胞的表达均明显高于正常对照组。结论：蚕蚀性角膜溃疡患者具有增强的细胞免疫和体液免疫，外周血T细胞及其亚群出现异常活化，反映患者体内存在自身免疫反应而支持该病发病之自身免疫学说。
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A study on lymphocyte immune epitopes and T lymphocyte activation
of peripheral blood of Mooren's ulcer patients
XIE Han-Ping,CHEN Jia-Qi,YANG Pei-Zeng,ZENG Yao-Ying,GE Qi,DI Jing-Fang,FENG Zheng,SUN Hong
Zhongshan Ophthalmic Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou(510060)
Abstract AIM:To analyze changes of lymphocyte immune epitopes and T lymphocyte activation of peripheral blood of Mooren's ulcer patients and to study changes of immune function of Mooren's ulcer patints.METHODS：30 immune epitopes expressing on lymphocytes of peripheral blood of 8 patients with active Mooren's ulcer were analyzed by flow cytometry,and using PHA and PDB as stimulators,the expressions of HLA-DR,CD69,CD71,and CD25 on T lymphocytes and its subpopulations of the periheral blood of Mooren's ulcer patients were detected by flow cytometry as the indicators of T lymphocyte activation.RESULTS：The expression rates of CD4,CD5,CD8,CD10,CD11b,CD15,CD16,CD19,CD23,CD25,CD41,CD57,CD69,HLA-DP,and HLA-DR were much higher than that of normal controls.The expression rates of HLA-DR,CD69,CD71,and CD25 on CD3+ and CD8+ of T lymphocytes of the peripheral blood of Mooren's ulcer patients were much higher than that of nomal controls.CONCLUSION：Mooren's ulcer patients have a strong activating capacity for cellular and humoral immune reactions and an aberrant activation of T lymphocyte and its subpopulations,indicating existence of autoimmune response in Mooren's ulcer patients.
, 百拇医药
MeSH Corneal ulcer; Immunophenotyping; Lymphocyte transformatioin; Flow cytometry
蚕蚀性角膜溃疡是角膜周边部的慢性、疼痛性溃疡，沿角膜周边部延伸，再向中央发展， 是一种复发性，可致盲性角膜病。前人研究表明，该病可能是一种自身免疫性疾病[1～3]，患者存在免疫调节紊乱。然而，本病的细胞和分子免疫机制以及患者免疫调节紊乱的细节尚不清楚。我们用流式细胞仪观察本病患者外周血淋巴细胞免疫表型变化和T细胞活化状态，在免疫调节的分子水平上进一步了解该病的免疫学发病机制。
材料与方法
(一)病例资料：取临床确诊的活动性蚕蚀性角膜溃疡患者8例(10眼)，男、女各4例，年龄24～53岁，均排除了可引起周边角膜溃疡的全身性疾病，并证实近期没有全身性使用过影响免疫功能的药物，另取身体健康者8例作对照，其中男性5例，女性3例，年龄20～35岁。两组年龄经统计学处理无显著性差异。
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(二)单克隆抗体和其它试剂：单克隆抗体为荧光异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)或藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的小鼠抗人单克隆抗体，系以下抗原的抗体：CD2～CD10，CD11a,CD11b,CD15～CD19，CD23，CD25，CD27，CD38，CD41，CD42，CD45，CD45 RA，CD57，CD69，CD71，HLA-ABC，HLA-DP、DR、DQ，IL-IR.p55，羊抗鼠anti lgG PE,anti CD3 FITC,anti CD8 FITC,均购自美国Becton Dikinson Immunocytometry,San Jose。
其它试剂包括植物凝集素(PHA)，沸波醇酯(PDB)，细胞培养液，胎牛血清等。
(三)实验方法：
1.淋巴细胞标记：采用单色或双色直接免疫荧光标记法。肝素抗凝静脉血30 μL与抗体10 μL混合，室温下孵育30 min，用红细胞裂解液(0.155 mol/L NH4Cl,0.01 mol/L KHCO3，0.1 mol/L MEDTA,pH 7.47)裂解红细胞，离心获取有核细胞，用PBS洗涤后，用1%多聚甲醛PBS固定10 min后用流式细胞仪分析。
, 百拇医药
2.淋巴细胞活化：取患者组和正常组肝素抗凝外周静脉血5 mL，采用全血体外培养法，分3组：
(1) 抗凝血按1∶2用完全RPMI-1640培养液稀释，在5%CO2，37 ℃条件下培养72 h。
(2) 第2组和第3组的抗凝血按1∶2用完全RPMI-1640培养液稀释，分别外加刺激剂PHA 20 μg/mL,PDB 0.1 μmol/mL，在5%CO2， 37℃条件下培养72 h。
3.流式细胞仪数据获取及分析：全部数据用流式细胞仪(FACStarplus,美国BD公司)和软件LYSYS Ⅱ进行双色或单色荧光参数获取及分析。在前散射和侧散射二维Dotplot图中，划出淋巴细胞区，然后对淋巴细胞作FITC 和PE的荧光强度检测，荧光Ⅰ(FL1)为FITC，滤光片为(530±10) nm带通，荧光Ⅱ(FL2)为PE，滤光片为(575±10) nm带通。数据分析时，在确定每次检测阳性细胞百分率之前，根据isotype的非特异性荧光强度设定界线，以确定双阴性、双阳性及单阳性区。
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4.统计方法：数据以
±s,表示，采用两样本t检验。
结果
(一)患者与对照组外周血淋巴细胞免疫表型的比较见表1，患者的CD4，CD5，CD8，CD10，CD11b,CD15,CD16，CD19，CD23，CD25，CD41，CD57，CD69，以及HLA-DP、DR的抗原阳性细胞显著高于正常人，CD45，CD45 RA的抗原阳性细胞明显低于正常人，其余的差异无显著。
表1 患者与对照组外周血淋巴细胞免疫表型的比较
Tab 1 The comparison of epitopes of the peripheral blood lymphocytes
, http://www.100md.com from Mooren's ulcer patients & normal controls (%,
±s,n=8) Item
Mooren's ulcer
Control
CD4
63.99±18.24**
34.78±9.32
CD5
73.54±15.29**
54.19±6.90
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CD8
41.19±20.77*
21.89±2.36
CD10
17.30±12.59**
1.78±0.93
CD11b
21.80±12.32**
7.13±1.82
CD15
24.93±24.10*
, 百拇医药
2.91±1.11
CD16
25.04±21.05*
7.33±4.89
CD19
18.89±12.22*
6.83±2.25
CD23
17.83±12.17*
2.93±1.64
CD41
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25.01±13.59**
5.60±3.33
CD45
83.75±5.28*
96.03±1.58
CD45RA
74.08±18.43*
91.85±2.85
CD57
36.28±18.69*
20.07±5.86
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CD69
26.50±21.01*
7.64±4.32
HLA-DP
43.29±21.00**
7.54±3.21
DHLA-DR
33.94±21.11*1
1.84±2.57
C253
7.33±25.17*
, 百拇医药
7.94±6.03
*P<0.05,**P<0.01,vs control
(二)患者与对照组外周血T细胞及其亚群HLA-DR，CD69，CD71，CD25在CD3和CD8表达的比较见表2，患者外周血同时表达CD3和HLA-DR的细胞为CD3阳性细胞的45.60%，而对照组为10.33%，表明患者外周血活化T细胞明显高于正常人。患者HLA-DR在CD8的表达率为54.10%，对照组为9.38%。此外，患者的CD69，CD25在CD3，CD8的表达率明显高于正常人。
表2 患者和正常人T细胞及其亚群HLA-DR,CD69,CD71,CD25在CD3和CD8的表达
Tab 2 Expression of HLA-DR,CD69,CD71 and CD25 on CD3 and
, 百拇医药
CD8 of T cells from Mooren's ulcer patients &
normal controls (%,
±s,n=8) Conditions
Mooren's ulcer
Control
HLA-DR+,CD3+/CD3+
45.60±17.85**
10.33±3.77
CD69+,CD3+/CD3+
, 百拇医药
48.31±29.78**
7.48±4.94
CD71+,CD3+/CD3+
24.45±17.21
10.90±7.24
CD25+,CD3+/CD3+
39.11±20.94**
14.95±2.60
HLA-DR+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
54.16±16.34**
9.38±8.80
CD69+,CD8+/CD8+
43.12±22.05**
4.75±4.45
CD71+,CD8+/CD8+
16.17±14.88
9.45±11.68
CD25+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
31.39±21.50*
6.02±7.61
*P<0.05,**P<0.01,vs control
患者和对照组外周血培养72 h T细胞活化的比较见表3，患者的HLA-DR，CD69，CD25在CD8的阳性表达率明显高于对照组。
表3 患者和对照组外周血培养72h T细胞活化的比较
Tab 3 The comparison of activation of T lymphocytes of the peripheral
blood cultured in vitro for 72 h from Mooren's ulcer patients &
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normal controls (%,±s,n=8) Conditions
Mooren's ulcer
Control
HLA-DR+,CD3+/CD3+
27.86±30.48
16.00±3.85
CD69+,CD3+/CD3+
17.83±13.26
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11.33±4.59
CD71+,CD3+/CD3+
16.91±16.92
19.36±12.90
CD25+,CD3+/CD3+
19.94±8.66
23.86±15.66
HLA-DR+,CD8+/CD8+
39.83±20.21*
, 百拇医药
15.18±5.59
CD69+,CD8+/CD8+
40.41±26.24**
11.00±6.96
CD71+,CD8+/CD8+
22.83±12.09
24.63±8.32
CD25+,CD8+/CD8+
28.97±12.70*
, 百拇医药
13.43±8.10
*P<0.05,**P<0.01,vs control
患者与对照组外周血加PHA体外培养72 h T细胞活化的比较见表4，患者的CD69在CD3的阳性表达率明显高于对照组，HLA-DR，CD69，CD25在CD8的阳性表达率明显高于对照组。
表4 患者与对照组外周血加PHA体外培养
72h T细胞活化的比较
Tab 4 The comparison of activation of T lymphocytes of the peripheral
blood cultured in vitro for 72 h with the stimulator of PHA from
, 百拇医药
Mooren's ulcer patients & normal controls (%,±s,n=8) Conditions
Mooren's ulcer
Control
HLA-DR+,CD3+/CD3+
32.03±14.74
34.03±17.14
CD69+,CD3+/CD3+
, 百拇医药
42.18±8.70*
26.53±12.60
CD71+,CD3+/CD3+
28.68±15.48
41.10±10.31
CD25+,CD3+/CD3+
45.80±9.30
38.76±13.00
HLA-DR+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
50.57±26.35*
22.56±8.58
CD69+,CD8+/CD8+
61.16±19.43**
20.06±9.12
CD71+,CD8+/CD8+
40.96±18.52
27.21±6.99
CD25+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
47.53±13.80*
22.43±5.84
*P<0.05,**P<0.01,vs control
患者与对照组外周血加入PDB体外培养72 h T细胞活化的比较见表5，患者的CD69和CD25在CD8的阳性表达率明显高于对照组。
表5 患者与对照组外周血加PDB体外培养
72h T细胞活化的比较
Tab 5 The comparison of activation of T lymphocytes of the peripheral
blood cultured in vitro for 72 h with the stimulator of PDB from
, 百拇医药
Mooren's ulcer patients & normal controls (%,
±s,n=8) Conditions
Mooren's ulcer
Control
HLA-DR+,CD3+/CD3+
35.05±30.60
39.73±13.12
CD69+,CD3+/CD3+
, 百拇医药
64.08±36.26
62.71±17.91
CD71+,CD3+/CD3+
27.84±16.99*
50.48±10.22
CD25+,CD3+/CD3+
35.47±23.32
45.95±26.20
HLA-DR+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
42.09±25.54
34.85±16.80
CD69+,CD8+/CD8+
82.83±22.60*
48.40±24.20
CD71+,CD8+/CD8+
29.83±27.09
24.06±8.51
CD25+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
48.33±27.38*
22.22±6.59
*P<0.05,vs control
讨论
研究表明，蚕蚀性角膜溃疡患者存在免疫调节紊乱。然而，其具体环节尚不清楚。有报道[4，5]，本病患者外周血抑制性T细胞较辅助性T细胞数量减少。李蕊红等认为本病患者外周血T淋巴细胞亚群无明显变化[6]。本结果表明，患者外周血CD4，CD5，CD8，CD10，CD11b，CD15，CD16，CD23，CD25，CD41，CD57，CD69，HLA-DP，HLA-DR等抗原表达阳性淋巴细胞明显高于正常人。CD4，CD5，CD8，是T细胞的分化抗原，CD10，CD19，CD23是B细胞的分化抗原，CD11b是补体受体(C3)，CD15介导白细胞和内皮细胞结合，CD16参与NK细胞活化，CD25组成高亲合力受体，与T细胞生长和增殖有关，CD69为一活化诱导分子。它们的异常高表达提示本病患者在多个环节存在着免疫调节紊乱。
, 百拇医药
器官特异性自身免疫性疾病的靶细胞可异常表达HLA-Ⅱ类抗原，一旦靶细胞异常表达Ⅱ类抗原，就可能以组织特异性方式把自身抗原提呈给自身反应性T细胞，从而启动自身免疫反应。本研究结果显示，患者外周血HLA-DP和DR表达较对照组明显升高。文献报道，蚕蚀性角膜溃疡病变角膜上皮和基质细胞，球结膜上皮细胞异常表达HLA-DR抗原[7]。HLA-Ⅱ类抗原在病变局部和外周血异常表达，提示患者机体对角膜组织发生了自身免疫反应。
HLA-DR为活化T细胞表达的分子，而静止的T细胞不表达HLA-DR[8]。因此，HLA-DR的表达常被作为T细胞活化的指标。由于所有B细胞和活化的T细胞均可表达HLA-DR，故只有同时使用CD3抗体和抗HLA-DR抗体进行双荧光标记，方能根据CD3和HLA-DR双阳性细胞数来确定活化的T细胞的比率[9]。本结果显示，正常人外周血CD3和HLA-DR双阳性的占CD3阳性细胞的10.33%。然而，本病患者外周血T细胞表达HLA-DR的细胞明显高于正常人。表明患者外周血T细胞在体内可能受到某种自身抗原或与自身抗原相似的分子刺激而过度活化[9]。
, 百拇医药
CD69是一种早期激活抗原，激活的T细胞，B细胞及巨噬细胞均表达此抗原。CD69阳性细胞在CD3和CD8的高表达提示患者机体处于免疫高活化状态。CD25是IL-2的受体，与IL-2增殖信息的传递有关。患者外周血T细胞及其亚群CD25的高表达说明患者外周血携带IL-2受体的T细胞明显高于正常人，患者外周血T细胞受到抗原刺激后更容易进入增殖状态。
研究表明，PHA和PDB对细胞活化的通路不同，PHA的活化作用是通过与T细胞表面的TCR肽链的结合而发挥的，PDB是一种蛋白激酶C的激活剂，它能进入细胞内激活蛋白激酶C而活化T细胞，绕过了活化信息跨膜传递分子如TCR/CD3等。我们的结果显示，本病患者的T细胞对PHA和PDB体外刺激的反应均明显高于正常人，表明患者机体的T细胞对不同作用部位和作用机制的有丝分裂原的刺激都处于高反应状态。用PHA和PDB刺激后，以HLA-DR，CD69，CD25在CD8阳性表达升高为主，其机制有待研究。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Lopez JS,Price FW Jr,Whitcup SM,et al.Immunohistochemistry of Terrien's and Mooren's corneal degeneration.Arch Ophthalmol,1991,109:988.
2 Brown SI,Mondino BJ,Rabin BS.Autoimmune phenomenon in Mooren's ulcer.Am J Ophthalmol,1976,82:835.
3 Gottsch JD,Lie SH,Minkovitz JB,et al.Autoimmunity to a cornea-associated stromal antigen in patients with Mooren's ulcer.Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36:1541.
, 百拇医药
4 Murray PI,Rahi AH.Pathogenesis of Mooren's ulcer: some new concepts.Br J Ophthalmol,1984,7:903.
5 赵京城，金秀英.蚕蚀性角膜溃疡发病机制的探讨.中华眼科杂志，1994，30：4.
6 李蕊红，张文华，郭玉华.蚕蚀性角膜溃疡患者外周血与病变处T淋巴细胞亚群分布的比较.眼科，1995，1：26.
7 王 铮，陈家琪，郑湖玲.蚕蚀性角膜溃疡及邻近球结膜的免疫组化研究.中华眼科杂志，1994，30：218.
8 Crabtree GR.Contingent genetic regulatory events in T lymphocyte activation.Science,1989,23:355.
9 蔡小嫦，林 泽，孙 荭，等.白癜风患者外周血的T淋巴细胞异常活化.中国病理生理杂志，1994，10：489.
(1998年6月23日收稿，1998年3月1日修回), http://www.100md.com
单位：陈家祺 杨培增：中山医科大学中山眼科中心(广州 510060)；谢汉平：重庆第三军医大学附属第一医院眼科(重庆 400038)；曾耀英 葛琪 狄静芳 冯铮 孙荭：暨南大学组织移植免疫中心
关键词：角膜溃疡；免疫表型分型；淋巴细胞转化；流式细胞术
中国病理生理杂志991022 摘要 目的：观察蚕蚀性角膜溃疡患者外周血淋巴细胞免疫表型和T细胞活化的变化，进一步探讨本病患者的免疫功能。方法：用流式细胞术检测8例活动性蚕蚀性角膜溃疡患者外周血淋巴细胞30项免疫表型变化，用植物凝集素和沸波醇酯作为刺激剂，以HLA-DR，CD69、CD71、CD25的表达为T细胞活化的指标，用流式细胞术分析。结果：蚕蚀性角膜溃疡患者外周血CD4、CD5、CD8、CD10、CD11b、CD15、CD16、CD19、CD23、CD25、CD41、CD57、CD69、HLA-DP、HLA-DR抗原表达阳性淋巴细胞以及HLA-DR、CD69、CD71、CD25在CD3和CD8细胞的表达均明显高于正常对照组。结论：蚕蚀性角膜溃疡患者具有增强的细胞免疫和体液免疫，外周血T细胞及其亚群出现异常活化，反映患者体内存在自身免疫反应而支持该病发病之自身免疫学说。
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of peripheral blood of Mooren's ulcer patients
XIE Han-Ping,CHEN Jia-Qi,YANG Pei-Zeng,ZENG Yao-Ying,GE Qi,DI Jing-Fang,FENG Zheng,SUN Hong
Zhongshan Ophthalmic Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou(510060)
Abstract AIM:To analyze changes of lymphocyte immune epitopes and T lymphocyte activation of peripheral blood of Mooren's ulcer patients and to study changes of immune function of Mooren's ulcer patints.METHODS：30 immune epitopes expressing on lymphocytes of peripheral blood of 8 patients with active Mooren's ulcer were analyzed by flow cytometry,and using PHA and PDB as stimulators,the expressions of HLA-DR,CD69,CD71,and CD25 on T lymphocytes and its subpopulations of the periheral blood of Mooren's ulcer patients were detected by flow cytometry as the indicators of T lymphocyte activation.RESULTS：The expression rates of CD4,CD5,CD8,CD10,CD11b,CD15,CD16,CD19,CD23,CD25,CD41,CD57,CD69,HLA-DP,and HLA-DR were much higher than that of normal controls.The expression rates of HLA-DR,CD69,CD71,and CD25 on CD3+ and CD8+ of T lymphocytes of the peripheral blood of Mooren's ulcer patients were much higher than that of nomal controls.CONCLUSION：Mooren's ulcer patients have a strong activating capacity for cellular and humoral immune reactions and an aberrant activation of T lymphocyte and its subpopulations,indicating existence of autoimmune response in Mooren's ulcer patients.
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蚕蚀性角膜溃疡是角膜周边部的慢性、疼痛性溃疡，沿角膜周边部延伸，再向中央发展， 是一种复发性，可致盲性角膜病。前人研究表明，该病可能是一种自身免疫性疾病[1～3]，患者存在免疫调节紊乱。然而，本病的细胞和分子免疫机制以及患者免疫调节紊乱的细节尚不清楚。我们用流式细胞仪观察本病患者外周血淋巴细胞免疫表型变化和T细胞活化状态，在免疫调节的分子水平上进一步了解该病的免疫学发病机制。
材料与方法
(一)病例资料：取临床确诊的活动性蚕蚀性角膜溃疡患者8例(10眼)，男、女各4例，年龄24～53岁，均排除了可引起周边角膜溃疡的全身性疾病，并证实近期没有全身性使用过影响免疫功能的药物，另取身体健康者8例作对照，其中男性5例，女性3例，年龄20～35岁。两组年龄经统计学处理无显著性差异。
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(二)单克隆抗体和其它试剂：单克隆抗体为荧光异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)或藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记的小鼠抗人单克隆抗体，系以下抗原的抗体：CD2～CD10，CD11a,CD11b,CD15～CD19，CD23，CD25，CD27，CD38，CD41，CD42，CD45，CD45 RA，CD57，CD69，CD71，HLA-ABC，HLA-DP、DR、DQ，IL-IR.p55，羊抗鼠anti lgG PE,anti CD3 FITC,anti CD8 FITC,均购自美国Becton Dikinson Immunocytometry,San Jose。
其它试剂包括植物凝集素(PHA)，沸波醇酯(PDB)，细胞培养液，胎牛血清等。
(三)实验方法：
1.淋巴细胞标记：采用单色或双色直接免疫荧光标记法。肝素抗凝静脉血30 μL与抗体10 μL混合，室温下孵育30 min，用红细胞裂解液(0.155 mol/L NH4Cl,0.01 mol/L KHCO3，0.1 mol/L MEDTA,pH 7.47)裂解红细胞，离心获取有核细胞，用PBS洗涤后，用1%多聚甲醛PBS固定10 min后用流式细胞仪分析。
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2.淋巴细胞活化：取患者组和正常组肝素抗凝外周静脉血5 mL，采用全血体外培养法，分3组：
(1) 抗凝血按1∶2用完全RPMI-1640培养液稀释，在5%CO2，37 ℃条件下培养72 h。
(2) 第2组和第3组的抗凝血按1∶2用完全RPMI-1640培养液稀释，分别外加刺激剂PHA 20 μg/mL,PDB 0.1 μmol/mL，在5%CO2， 37℃条件下培养72 h。
3.流式细胞仪数据获取及分析：全部数据用流式细胞仪(FACStarplus,美国BD公司)和软件LYSYS Ⅱ进行双色或单色荧光参数获取及分析。在前散射和侧散射二维Dotplot图中，划出淋巴细胞区，然后对淋巴细胞作FITC 和PE的荧光强度检测，荧光Ⅰ(FL1)为FITC，滤光片为(530±10) nm带通，荧光Ⅱ(FL2)为PE，滤光片为(575±10) nm带通。数据分析时，在确定每次检测阳性细胞百分率之前，根据isotype的非特异性荧光强度设定界线，以确定双阴性、双阳性及单阳性区。
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4.统计方法：数据以
±s,表示，采用两样本t检验。结果
(一)患者与对照组外周血淋巴细胞免疫表型的比较见表1，患者的CD4，CD5，CD8，CD10，CD11b,CD15,CD16，CD19，CD23，CD25，CD41，CD57，CD69，以及HLA-DP、DR的抗原阳性细胞显著高于正常人，CD45，CD45 RA的抗原阳性细胞明显低于正常人，其余的差异无显著。
表1 患者与对照组外周血淋巴细胞免疫表型的比较
Tab 1 The comparison of epitopes of the peripheral blood lymphocytes
, http://www.100md.com from Mooren's ulcer patients & normal controls (%,
±s,n=8) ItemMooren's ulcer
Control
CD4
63.99±18.24**
34.78±9.32
CD5
73.54±15.29**
54.19±6.90
, http://www.100md.com
CD8
41.19±20.77*
21.89±2.36
CD10
17.30±12.59**
1.78±0.93
CD11b
21.80±12.32**
7.13±1.82
CD15
24.93±24.10*
, 百拇医药
2.91±1.11
CD16
25.04±21.05*
7.33±4.89
CD19
18.89±12.22*
6.83±2.25
CD23
17.83±12.17*
2.93±1.64
CD41
, http://www.100md.com
25.01±13.59**
5.60±3.33
CD45
83.75±5.28*
96.03±1.58
CD45RA
74.08±18.43*
91.85±2.85
CD57
36.28±18.69*
20.07±5.86
, http://www.100md.com
CD69
26.50±21.01*
7.64±4.32
HLA-DP
43.29±21.00**
7.54±3.21
DHLA-DR
33.94±21.11*1
1.84±2.57
C253
7.33±25.17*
, 百拇医药
7.94±6.03
*P<0.05,**P<0.01,vs control
(二)患者与对照组外周血T细胞及其亚群HLA-DR，CD69，CD71，CD25在CD3和CD8表达的比较见表2，患者外周血同时表达CD3和HLA-DR的细胞为CD3阳性细胞的45.60%，而对照组为10.33%，表明患者外周血活化T细胞明显高于正常人。患者HLA-DR在CD8的表达率为54.10%，对照组为9.38%。此外，患者的CD69，CD25在CD3，CD8的表达率明显高于正常人。
表2 患者和正常人T细胞及其亚群HLA-DR,CD69,CD71,CD25在CD3和CD8的表达
Tab 2 Expression of HLA-DR,CD69,CD71 and CD25 on CD3 and
, 百拇医药
CD8 of T cells from Mooren's ulcer patients &
normal controls (%,
±s,n=8) ConditionsMooren's ulcer
Control
HLA-DR+,CD3+/CD3+
45.60±17.85**
10.33±3.77
CD69+,CD3+/CD3+
, 百拇医药
48.31±29.78**
7.48±4.94
CD71+,CD3+/CD3+
24.45±17.21
10.90±7.24
CD25+,CD3+/CD3+
39.11±20.94**
14.95±2.60
HLA-DR+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
54.16±16.34**
9.38±8.80
CD69+,CD8+/CD8+
43.12±22.05**
4.75±4.45
CD71+,CD8+/CD8+
16.17±14.88
9.45±11.68
CD25+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
31.39±21.50*
6.02±7.61
*P<0.05,**P<0.01,vs control
患者和对照组外周血培养72 h T细胞活化的比较见表3，患者的HLA-DR，CD69，CD25在CD8的阳性表达率明显高于对照组。
表3 患者和对照组外周血培养72h T细胞活化的比较
Tab 3 The comparison of activation of T lymphocytes of the peripheral
blood cultured in vitro for 72 h from Mooren's ulcer patients &
, http://www.100md.com
normal controls (%,
±s,n=8) ConditionsMooren's ulcer
Control
HLA-DR+,CD3+/CD3+
27.86±30.48
16.00±3.85
CD69+,CD3+/CD3+
17.83±13.26
, http://www.100md.com
11.33±4.59
CD71+,CD3+/CD3+
16.91±16.92
19.36±12.90
CD25+,CD3+/CD3+
19.94±8.66
23.86±15.66
HLA-DR+,CD8+/CD8+
39.83±20.21*
, 百拇医药
15.18±5.59
CD69+,CD8+/CD8+
40.41±26.24**
11.00±6.96
CD71+,CD8+/CD8+
22.83±12.09
24.63±8.32
CD25+,CD8+/CD8+
28.97±12.70*
, 百拇医药
13.43±8.10
*P<0.05,**P<0.01,vs control
患者与对照组外周血加PHA体外培养72 h T细胞活化的比较见表4，患者的CD69在CD3的阳性表达率明显高于对照组，HLA-DR，CD69，CD25在CD8的阳性表达率明显高于对照组。
表4 患者与对照组外周血加PHA体外培养
72h T细胞活化的比较
Tab 4 The comparison of activation of T lymphocytes of the peripheral
blood cultured in vitro for 72 h with the stimulator of PHA from
, 百拇医药
Mooren's ulcer patients & normal controls (%,
±s,n=8) ConditionsMooren's ulcer
Control
HLA-DR+,CD3+/CD3+
32.03±14.74
34.03±17.14
CD69+,CD3+/CD3+
, 百拇医药
42.18±8.70*
26.53±12.60
CD71+,CD3+/CD3+
28.68±15.48
41.10±10.31
CD25+,CD3+/CD3+
45.80±9.30
38.76±13.00
HLA-DR+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
50.57±26.35*
22.56±8.58
CD69+,CD8+/CD8+
61.16±19.43**
20.06±9.12
CD71+,CD8+/CD8+
40.96±18.52
27.21±6.99
CD25+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
47.53±13.80*
22.43±5.84
*P<0.05,**P<0.01,vs control
患者与对照组外周血加入PDB体外培养72 h T细胞活化的比较见表5，患者的CD69和CD25在CD8的阳性表达率明显高于对照组。
表5 患者与对照组外周血加PDB体外培养
72h T细胞活化的比较
Tab 5 The comparison of activation of T lymphocytes of the peripheral
blood cultured in vitro for 72 h with the stimulator of PDB from
, 百拇医药
Mooren's ulcer patients & normal controls (%,
±s,n=8) ConditionsMooren's ulcer
Control
HLA-DR+,CD3+/CD3+
35.05±30.60
39.73±13.12
CD69+,CD3+/CD3+
, 百拇医药
64.08±36.26
62.71±17.91
CD71+,CD3+/CD3+
27.84±16.99*
50.48±10.22
CD25+,CD3+/CD3+
35.47±23.32
45.95±26.20
HLA-DR+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
42.09±25.54
34.85±16.80
CD69+,CD8+/CD8+
82.83±22.60*
48.40±24.20
CD71+,CD8+/CD8+
29.83±27.09
24.06±8.51
CD25+,CD8+/CD8+
, 百拇医药
48.33±27.38*
22.22±6.59
*P<0.05,vs control
讨论
研究表明，蚕蚀性角膜溃疡患者存在免疫调节紊乱。然而，其具体环节尚不清楚。有报道[4，5]，本病患者外周血抑制性T细胞较辅助性T细胞数量减少。李蕊红等认为本病患者外周血T淋巴细胞亚群无明显变化[6]。本结果表明，患者外周血CD4，CD5，CD8，CD10，CD11b，CD15，CD16，CD23，CD25，CD41，CD57，CD69，HLA-DP，HLA-DR等抗原表达阳性淋巴细胞明显高于正常人。CD4，CD5，CD8，是T细胞的分化抗原，CD10，CD19，CD23是B细胞的分化抗原，CD11b是补体受体(C3)，CD15介导白细胞和内皮细胞结合，CD16参与NK细胞活化，CD25组成高亲合力受体，与T细胞生长和增殖有关，CD69为一活化诱导分子。它们的异常高表达提示本病患者在多个环节存在着免疫调节紊乱。
, 百拇医药
器官特异性自身免疫性疾病的靶细胞可异常表达HLA-Ⅱ类抗原，一旦靶细胞异常表达Ⅱ类抗原，就可能以组织特异性方式把自身抗原提呈给自身反应性T细胞，从而启动自身免疫反应。本研究结果显示，患者外周血HLA-DP和DR表达较对照组明显升高。文献报道，蚕蚀性角膜溃疡病变角膜上皮和基质细胞，球结膜上皮细胞异常表达HLA-DR抗原[7]。HLA-Ⅱ类抗原在病变局部和外周血异常表达，提示患者机体对角膜组织发生了自身免疫反应。
HLA-DR为活化T细胞表达的分子，而静止的T细胞不表达HLA-DR[8]。因此，HLA-DR的表达常被作为T细胞活化的指标。由于所有B细胞和活化的T细胞均可表达HLA-DR，故只有同时使用CD3抗体和抗HLA-DR抗体进行双荧光标记，方能根据CD3和HLA-DR双阳性细胞数来确定活化的T细胞的比率[9]。本结果显示，正常人外周血CD3和HLA-DR双阳性的占CD3阳性细胞的10.33%。然而，本病患者外周血T细胞表达HLA-DR的细胞明显高于正常人。表明患者外周血T细胞在体内可能受到某种自身抗原或与自身抗原相似的分子刺激而过度活化[9]。
, 百拇医药
CD69是一种早期激活抗原，激活的T细胞，B细胞及巨噬细胞均表达此抗原。CD69阳性细胞在CD3和CD8的高表达提示患者机体处于免疫高活化状态。CD25是IL-2的受体，与IL-2增殖信息的传递有关。患者外周血T细胞及其亚群CD25的高表达说明患者外周血携带IL-2受体的T细胞明显高于正常人，患者外周血T细胞受到抗原刺激后更容易进入增殖状态。
研究表明，PHA和PDB对细胞活化的通路不同，PHA的活化作用是通过与T细胞表面的TCR肽链的结合而发挥的，PDB是一种蛋白激酶C的激活剂，它能进入细胞内激活蛋白激酶C而活化T细胞，绕过了活化信息跨膜传递分子如TCR/CD3等。我们的结果显示，本病患者的T细胞对PHA和PDB体外刺激的反应均明显高于正常人，表明患者机体的T细胞对不同作用部位和作用机制的有丝分裂原的刺激都处于高反应状态。用PHA和PDB刺激后，以HLA-DR，CD69，CD25在CD8阳性表达升高为主，其机制有待研究。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Lopez JS,Price FW Jr,Whitcup SM,et al.Immunohistochemistry of Terrien's and Mooren's corneal degeneration.Arch Ophthalmol,1991,109:988.
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3 Gottsch JD,Lie SH,Minkovitz JB,et al.Autoimmunity to a cornea-associated stromal antigen in patients with Mooren's ulcer.Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36:1541.
, 百拇医药
4 Murray PI,Rahi AH.Pathogenesis of Mooren's ulcer: some new concepts.Br J Ophthalmol,1984,7:903.
5 赵京城，金秀英.蚕蚀性角膜溃疡发病机制的探讨.中华眼科杂志，1994，30：4.
6 李蕊红，张文华，郭玉华.蚕蚀性角膜溃疡患者外周血与病变处T淋巴细胞亚群分布的比较.眼科，1995，1：26.
7 王 铮，陈家琪，郑湖玲.蚕蚀性角膜溃疡及邻近球结膜的免疫组化研究.中华眼科杂志，1994，30：218.
8 Crabtree GR.Contingent genetic regulatory events in T lymphocyte activation.Science,1989,23:355.
9 蔡小嫦，林 泽，孙 荭，等.白癜风患者外周血的T淋巴细胞异常活化.中国病理生理杂志，1994，10：489.
(1998年6月23日收稿，1998年3月1日修回), http://www.100md.com