多药耐药基因与脑胶质瘤
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作者：贺昭忠 杨新生
单位：贺昭忠(青岛大学医学院附属医院神经外科 青岛 266003)；杨新生(青岛大学医学院附属医院神经外科 青岛 266003)
关键词：脑；神经胶质瘤；药物耐受性；基因表达
齐鲁医学杂志000153 [中图分类号] R739.41 [文献标识码] A
[文章编号] 1008-0341(2000)01-0071-02
脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，约占颅内肿瘤的40%.由于其呈浸润性生长，与周围正常 脑组织无明显边界，手术很难做到全切除。因此，脑胶质瘤的术后化疗具有极其重要的意义 。然而各类肿瘤细胞对化疗药物产生抗药性又极大地降低了化疗药物的效果。目前，研究发 现肿瘤细胞产生耐药原因极其复杂[1]，最常见的是多药耐药(MDR)现象，即肿瘤 细胞一旦对 一种化疗药物产生耐药，则对其他结构及功能不同的化疗药物也产生交叉耐药。关于脑胶质 瘤多药耐药性的研究将有助于阐明胶质瘤抗药性的产生及化疗效果差的可能机制，并探 讨其抗药性的逆转机制，从而为寻找治疗脑胶质瘤的有效方法提供理论依据。
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1 MDR基因的分子结构和功能
人类基因组中有两个MDR基因：MDR1和MDR2.MDR1基因的表达水平与人体肿瘤细胞耐药有关， 而MDR2则与耐药无关[2]。在MDR细胞膜上有一种相对分子质量为1.7×105的糖蛋 白称之为P-糖蛋白(P-gp)，它是由Juliano等[3]在中国仓鼠的卵巢细胞秋 水仙素耐药株中发现的。研究发现该蛋白的表达水平与细胞膜的通透性、细胞内药物浓度以 及细胞耐药程度有关。MDR1基因的序列分析结果表明，P-gp约由1 200个氨基酸组成，在第 一600碱基对和第二600碱基对间存在有48%的同源部分，每一部分都含有6个跨膜疏水区和 1个ATP结合位点，故完整P-gp分子共有12个跨膜疏水区和两个ATP结合位点。这种P-gp跨 膜结构具有能量依赖性“药泵”功能，P-gp有与抗癌药物结合的位点，也有与ATP结合的位 点。ATP主要是提供能量，能使细胞内药物转出细胞外，造成细胞内药物浓度下降，细胞毒 作用降低或完全丧失，细胞产生耐药。故P-gp是细胞产生MDR表型的分子基础，具有MDR的 肿瘤细胞，MDR1基因表达水平与耐药程度呈正比[4]。
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2 MDR1基因在正常组织中的表达与调控
用特异性探针检测MDR1在人组织中的表达具有组织特异性。正常人肾脏、肾上腺、直肠、 空肠、肝脏和肺组织中MDR1基因表达水平较高，而皮肤、皮下组织、骨骼肌、心脏、脾脏、 骨髓、淋巴细胞、卵巢的MDR1基因呈低水平表达。研究表明，P-糖蛋白主要存在于有分泌 和排泄功能的专业化上皮细胞膜上，在维持某些器官的正常生理功能和药物或毒物解毒过程 中起一定作用[5]。在正常脑组织中MDR1基因不表达[6]。MDR1基因的表达 调控机制十分复杂，可发生于不同水平，包括：①基因扩增：人及动物的某些高度耐药的MD R1细胞株基因扩增很明显，基因拷贝增加可高达10余倍；②转录及转录后调节：有些MDR1细 胞株仅表现为细胞MDR1-mRNA和P-gp表达水平升高，而基因的拷贝数无明显的变化，提 示P-gp的高度表达是转录速度提高或mRNA的稳定性增加，半衰期延长所致。临床肿瘤 组织基因扩增不明显，MDR1基因高度表达，调控机制可能主要发生于转录或转录后水平；③ 翻译及翻译后调节：某些MDR1高度表达的细胞株，MDR1基因拷贝数及mRNA水平无变化。可能 与翻译速率提高或P-gp的稳定性增加有关。MDR1基因的表达除了受化疗药物的诱导激 活外，还受到某些因子的调节。用MDR1基因与突变的ras和P53基因共同导入N1H3T3细 胞中，发现突变的ras和P53基因能激活MDR1基因的启动子，促进MDR1基因的表达[7] 。此外，应激蛋白的表达也可以激活MDR1基因的表达[8]。
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3 MDR1基因在脑胶质瘤中的表达
临床肿瘤的检测分析表明,所有人类中的MDR1基因的表达均有不同程度的升高。研究证实，M DR1-mRNA及P-gp与抗药类型之间有着良好的平行关系[9]。Henson等[10] 使用HYB241单抗发现76%(37/49)的脑胶质瘤呈现P-gp阳性表达。国内鲁质成等[11 ]检测了45例脑胶质瘤，结果P-gp的阳性表达率为66.67%.另外，化疗可诱发MDR1基因 在脑胶质瘤中的表达。Nabor等[12]研究发现未经化疗的神经母细胞瘤仅有6% MDR 1基因呈高度表达，而化疗后MDR1基因的高水平表达达到42%.鲁质成等[11]报 道的45例脑胶质瘤化疗后70%呈MDR1阳性表达。同一类肿瘤分化程度不同其MDR1的表达量也 不相同 。分化好的肿瘤MDR1表达量要明显低于分化差或分化中等的肿瘤。这也与分化差的肿瘤对化 疗不敏感相一致[13]。另外，由于肿瘤细胞异质性的存在，MDR1基因表达具有不均 匀性，由于取材等原因不易检测到MDR1阳性表达，而这些细胞在化疗过程中具有强烈的耐药 性和生长优势，因而继续保留并增殖，导致肿瘤最终复发[14]。
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脑胶质瘤中MDR1基因表达率各家报道不尽一致。可能是由于所采用的检测方法及判断结果 的标准不同所致。目前常用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)的方法检测mRNA和采用免疫组 化的方法检测P-gp，尽管在阳性表达程度上两种检测结果不完全相同。但文献报道，mRNA 和P-gp表达具有明显相关性[15]。
4 MDR1在基因治疗中的应用
化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，但反复化疗容易使肿瘤组织产生耐药性，为了取得 好的治疗效果就需要加大化疗药物剂量，随之而来的就会产生许多副作用。其中对治疗影 响最大的就是出现骨髓抑制，进而引起出血、感染等并发症，影响治疗的进行。所以在化疗 中保护骨髓造血干细胞免受损害成为治疗的关键。近年来国内外已研究将人的 MDR1导入造血干细胞(HSC)以防护大剂量化疗药物对其的损害[16]。这种研究的 思路是首先分离提取人类MDR1基因，经RT-PCR体外扩增MDR1-cDNA，选择合适的 载体(逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒等)行重组表达，转染HSC，经化疗药物或 PCR方法筛选阳性细胞进行体外抗化疗药物试验，证明其多药耐药性，再将导入MDR1基因的H SC回输入体内，给予多种化疗药物联合使用，观察其体内抗化疗药物的效果。选用的靶细胞 包括骨髓造血干细胞，外周血造血干细胞，脐血造血干细胞等。以往常用者为骨髓HSC，因 骨髓HSC含量丰富。但存在的问题是骨髓取材相对困难，供者有一定痛苦。外周血HSC含量极 少，仅为骨髓的0.1%[17]，但若在取材前投用细胞因子，如干细胞因子、白细胞 介素3， 白细胞介素6,粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子等，则可动员骨髓HSC增殖，并释放入外周 血，使外周血HSC含量明显增加，同时增加MDR1基因的转染效率。近年来，人们发现脐血中 含有丰富的HSC，脐血中粒细胞及巨噬细胞集落形成单位的频率超过成人骨髓，来自脐血的H SC在外周骨髓细胞培养基上可生存达120d.Bertolini等[18]报道脐血HSC的MDR1基 因转染 高于骨髓HSC.脐血来源广泛，取材方便，对母婴皆无不利影响，可替代骨髓HSC作MDR1基因 转染的靶细胞。近年来的实验研究已经证明了这种治疗方法对防护大剂量化疗引起骨髓抑制 的有效性及此治疗方法的可行性，尤其是MDR1基因导入脐血造血干细胞的研究为基因治疗靶 细胞的来源开辟了一个新的途径。
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作者简介 贺昭忠，男，1962年11月生，硕士，主治医师
参考文献
1，Grant CE, Valdimarsson G, Hipfner DR, et al. Overexpression o f multidrug resistance-associated protein( MRP) increases resistance to natural product drugs[J]. Cancer Res,1994,54:359
2，Hsu S, Cohen D, Kirschner LS, et al. Structural analysis of the mouse MDR promoter reveals the basis for differential transcript heterog eneity in multidrug resistance J744.2 cells[J]. Mol Cell Biol, 1 990,10:3596
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3，Juliano R, Ling V. A surface glyceprotein modulating durg permeability in chinese hamster ovary cell mutants[J].Bioch Biophys Acta,1976,455:152
4，Bradley G, Peter F, Ling V. Mechanism of multidrug resistance[J] .Bioch Biophys Acta,1988,948:87
5，Fojo A, Ueda K, Slamon D. Expression of a multidrugg resis tance gene in human tumors and tissues[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1987,84:256
6，Nabor MW, Griffin C, Zehnbauer B, et al. Multidurg resistance gene expression in human brain tumors[J]. J Neurosurg,1991,75:941
, 百拇医药
7，Chin K, Ueda K, Pastan I, et al. Modulation of the activity of the promoter of the humor MDR1 gene by P53 and ras[J].Science,1992,255 :459
8，Kioka N, Hosokawa N, Komamo T. Quercitin a biolaronoid inhi bit the increase of human multidurg resistance gene expression caused by a rssnite[J]. FEBNS Lett,1992,301:307
9，Weinstein RS, Kuszak JR. P-glycoprotein in pathology the mul tidurg resistance gene family in human[J]. Human Pathol,1990,21:34
, 百拇医药
10，Henson JW, Cordon C, Posner JB. P- glycoprotein expression in brain tumors[J]. J Neurooncol, 1992,14:37
11，鲁质成，王为民，王 苹，等. MDR1基因及P-gp在脑胶质瘤中定量表达的研 究[J]. 中风与神经疾病杂志,1998,15(2):84
12，Nabor MW,Griffin C,Zehnbauer B, et al. Multidurg resistance gen e expression in human brain tumors[J]. J Neurosurg,1991,75:941
13，Bittl A, Nap M, Jager W, et al. Immunohistochemical analysis of P-glycoprotein expression in diverse histological types of epithelial ov arian tumors[J]. Acta Med Okayama, 1994,48: 249
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14，Pileri S, Sabatlini E, Falini B, et al. Immuno-histochemical dete ction of the multidurg transpot protein P170 in human normal and malignant lymphomas, significance and malignant lymphomas[J]. Histopatholy, 199 1,19：131
15，Arceci RJ.Clinical significance of P-glycoprotein in multidurg resistance malignancier[J]. Blood, 1993,81: 2215
16，王立生，裴雪涛，徐 黎，等.逆转录病毒介导的多药耐药基因导入人骨髓C D+34细胞的实验研究[J].中华血液学杂志，1998,157 :258
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17，Bodine DM, Seidel NE, Zsebo KM, et al.In vivo administration stem cell facton to mice increase the absolute number of pluripotent hena topoietic stem cells[J]. Blood, 1993,83(2):445
18，Bertolini F, Monte LD, Corsini C, et al. Retrovirus-me diated transfer of the multidrug resistance gene into human hematopoiet ic progenitor cells[J]. Br J Haematol,1994,88(2):318
(1999-11-24收稿 2000-02-29修回), http://www.100md.com
单位：贺昭忠(青岛大学医学院附属医院神经外科 青岛 266003)；杨新生(青岛大学医学院附属医院神经外科 青岛 266003)
关键词：脑；神经胶质瘤；药物耐受性；基因表达
齐鲁医学杂志000153 [中图分类号] R739.41 [文献标识码] A
[文章编号] 1008-0341(2000)01-0071-02
脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，约占颅内肿瘤的40%.由于其呈浸润性生长，与周围正常 脑组织无明显边界，手术很难做到全切除。因此，脑胶质瘤的术后化疗具有极其重要的意义 。然而各类肿瘤细胞对化疗药物产生抗药性又极大地降低了化疗药物的效果。目前，研究发 现肿瘤细胞产生耐药原因极其复杂[1]，最常见的是多药耐药(MDR)现象，即肿瘤 细胞一旦对 一种化疗药物产生耐药，则对其他结构及功能不同的化疗药物也产生交叉耐药。关于脑胶质 瘤多药耐药性的研究将有助于阐明胶质瘤抗药性的产生及化疗效果差的可能机制，并探 讨其抗药性的逆转机制，从而为寻找治疗脑胶质瘤的有效方法提供理论依据。
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1 MDR基因的分子结构和功能
人类基因组中有两个MDR基因：MDR1和MDR2.MDR1基因的表达水平与人体肿瘤细胞耐药有关， 而MDR2则与耐药无关[2]。在MDR细胞膜上有一种相对分子质量为1.7×105的糖蛋 白称之为P-糖蛋白(P-gp)，它是由Juliano等[3]在中国仓鼠的卵巢细胞秋 水仙素耐药株中发现的。研究发现该蛋白的表达水平与细胞膜的通透性、细胞内药物浓度以 及细胞耐药程度有关。MDR1基因的序列分析结果表明，P-gp约由1 200个氨基酸组成，在第 一600碱基对和第二600碱基对间存在有48%的同源部分，每一部分都含有6个跨膜疏水区和 1个ATP结合位点，故完整P-gp分子共有12个跨膜疏水区和两个ATP结合位点。这种P-gp跨 膜结构具有能量依赖性“药泵”功能，P-gp有与抗癌药物结合的位点，也有与ATP结合的位 点。ATP主要是提供能量，能使细胞内药物转出细胞外，造成细胞内药物浓度下降，细胞毒 作用降低或完全丧失，细胞产生耐药。故P-gp是细胞产生MDR表型的分子基础，具有MDR的 肿瘤细胞，MDR1基因表达水平与耐药程度呈正比[4]。
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2 MDR1基因在正常组织中的表达与调控
用特异性探针检测MDR1在人组织中的表达具有组织特异性。正常人肾脏、肾上腺、直肠、 空肠、肝脏和肺组织中MDR1基因表达水平较高，而皮肤、皮下组织、骨骼肌、心脏、脾脏、 骨髓、淋巴细胞、卵巢的MDR1基因呈低水平表达。研究表明，P-糖蛋白主要存在于有分泌 和排泄功能的专业化上皮细胞膜上，在维持某些器官的正常生理功能和药物或毒物解毒过程 中起一定作用[5]。在正常脑组织中MDR1基因不表达[6]。MDR1基因的表达 调控机制十分复杂，可发生于不同水平，包括：①基因扩增：人及动物的某些高度耐药的MD R1细胞株基因扩增很明显，基因拷贝增加可高达10余倍；②转录及转录后调节：有些MDR1细 胞株仅表现为细胞MDR1-mRNA和P-gp表达水平升高，而基因的拷贝数无明显的变化，提 示P-gp的高度表达是转录速度提高或mRNA的稳定性增加，半衰期延长所致。临床肿瘤 组织基因扩增不明显，MDR1基因高度表达，调控机制可能主要发生于转录或转录后水平；③ 翻译及翻译后调节：某些MDR1高度表达的细胞株，MDR1基因拷贝数及mRNA水平无变化。可能 与翻译速率提高或P-gp的稳定性增加有关。MDR1基因的表达除了受化疗药物的诱导激 活外，还受到某些因子的调节。用MDR1基因与突变的ras和P53基因共同导入N1H3T3细 胞中，发现突变的ras和P53基因能激活MDR1基因的启动子，促进MDR1基因的表达[7] 。此外，应激蛋白的表达也可以激活MDR1基因的表达[8]。
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3 MDR1基因在脑胶质瘤中的表达
临床肿瘤的检测分析表明,所有人类中的MDR1基因的表达均有不同程度的升高。研究证实，M DR1-mRNA及P-gp与抗药类型之间有着良好的平行关系[9]。Henson等[10] 使用HYB241单抗发现76%(37/49)的脑胶质瘤呈现P-gp阳性表达。国内鲁质成等[11 ]检测了45例脑胶质瘤，结果P-gp的阳性表达率为66.67%.另外，化疗可诱发MDR1基因 在脑胶质瘤中的表达。Nabor等[12]研究发现未经化疗的神经母细胞瘤仅有6% MDR 1基因呈高度表达，而化疗后MDR1基因的高水平表达达到42%.鲁质成等[11]报 道的45例脑胶质瘤化疗后70%呈MDR1阳性表达。同一类肿瘤分化程度不同其MDR1的表达量也 不相同 。分化好的肿瘤MDR1表达量要明显低于分化差或分化中等的肿瘤。这也与分化差的肿瘤对化 疗不敏感相一致[13]。另外，由于肿瘤细胞异质性的存在，MDR1基因表达具有不均 匀性，由于取材等原因不易检测到MDR1阳性表达，而这些细胞在化疗过程中具有强烈的耐药 性和生长优势，因而继续保留并增殖，导致肿瘤最终复发[14]。
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脑胶质瘤中MDR1基因表达率各家报道不尽一致。可能是由于所采用的检测方法及判断结果 的标准不同所致。目前常用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)的方法检测mRNA和采用免疫组 化的方法检测P-gp，尽管在阳性表达程度上两种检测结果不完全相同。但文献报道，mRNA 和P-gp表达具有明显相关性[15]。
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化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，但反复化疗容易使肿瘤组织产生耐药性，为了取得 好的治疗效果就需要加大化疗药物剂量，随之而来的就会产生许多副作用。其中对治疗影 响最大的就是出现骨髓抑制，进而引起出血、感染等并发症，影响治疗的进行。所以在化疗 中保护骨髓造血干细胞免受损害成为治疗的关键。近年来国内外已研究将人的 MDR1导入造血干细胞(HSC)以防护大剂量化疗药物对其的损害[16]。这种研究的 思路是首先分离提取人类MDR1基因，经RT-PCR体外扩增MDR1-cDNA，选择合适的 载体(逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒等)行重组表达，转染HSC，经化疗药物或 PCR方法筛选阳性细胞进行体外抗化疗药物试验，证明其多药耐药性，再将导入MDR1基因的H SC回输入体内，给予多种化疗药物联合使用，观察其体内抗化疗药物的效果。选用的靶细胞 包括骨髓造血干细胞，外周血造血干细胞，脐血造血干细胞等。以往常用者为骨髓HSC，因 骨髓HSC含量丰富。但存在的问题是骨髓取材相对困难，供者有一定痛苦。外周血HSC含量极 少，仅为骨髓的0.1%[17]，但若在取材前投用细胞因子，如干细胞因子、白细胞 介素3， 白细胞介素6,粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子等，则可动员骨髓HSC增殖，并释放入外周 血，使外周血HSC含量明显增加，同时增加MDR1基因的转染效率。近年来，人们发现脐血中 含有丰富的HSC，脐血中粒细胞及巨噬细胞集落形成单位的频率超过成人骨髓，来自脐血的H SC在外周骨髓细胞培养基上可生存达120d.Bertolini等[18]报道脐血HSC的MDR1基 因转染 高于骨髓HSC.脐血来源广泛，取材方便，对母婴皆无不利影响，可替代骨髓HSC作MDR1基因 转染的靶细胞。近年来的实验研究已经证明了这种治疗方法对防护大剂量化疗引起骨髓抑制 的有效性及此治疗方法的可行性，尤其是MDR1基因导入脐血造血干细胞的研究为基因治疗靶 细胞的来源开辟了一个新的途径。
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作者简介 贺昭忠，男，1962年11月生，硕士，主治医师
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1，Grant CE, Valdimarsson G, Hipfner DR, et al. Overexpression o f multidrug resistance-associated protein( MRP) increases resistance to natural product drugs[J]. Cancer Res,1994,54:359
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5，Fojo A, Ueda K, Slamon D. Expression of a multidrugg resis tance gene in human tumors and tissues[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1987,84:256
6，Nabor MW, Griffin C, Zehnbauer B, et al. Multidurg resistance gene expression in human brain tumors[J]. J Neurosurg,1991,75:941
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10，Henson JW, Cordon C, Posner JB. P- glycoprotein expression in brain tumors[J]. J Neurooncol, 1992,14:37
11，鲁质成，王为民，王 苹，等. MDR1基因及P-gp在脑胶质瘤中定量表达的研 究[J]. 中风与神经疾病杂志,1998,15(2):84
12，Nabor MW,Griffin C,Zehnbauer B, et al. Multidurg resistance gen e expression in human brain tumors[J]. J Neurosurg,1991,75:941
13，Bittl A, Nap M, Jager W, et al. Immunohistochemical analysis of P-glycoprotein expression in diverse histological types of epithelial ov arian tumors[J]. Acta Med Okayama, 1994,48: 249
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14，Pileri S, Sabatlini E, Falini B, et al. Immuno-histochemical dete ction of the multidurg transpot protein P170 in human normal and malignant lymphomas, significance and malignant lymphomas[J]. Histopatholy, 199 1,19：131
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(1999-11-24收稿 2000-02-29修回), http://www.100md.com