变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段在减毒鼠伤寒沙门氏菌的表达
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37c医学网
作者：陈罕 凌均棨 杨国平
单位：中山医科大学口腔医学院口腔内科, 广东 广州 510060
关键词：变形链球菌；沙门氏菌；鼠伤寒；表面蛋白Pac
00zk19摘 要：【目的】 检测携带变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段的重组质粒pET-17b/A在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261的表达情况。【方法】 应用SDS-PAGE技术检测重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中是否有新的蛋白条带，Western blot检测条带的抗原性。【结果】 SDS-PAGE显示重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中有35 ku的新蛋白条带，Western blot显示在相应的位置上有特异的条带。【结论】 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261表达的变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段具有抗原性。
中图分类号： R378.1； R781.1 文献标识码： A
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文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0068-04
A in Expression of Streptococcus mutans pac Gene Region
Attenuated Salmonella typhimurium
CHEN Han, LING Jun-qi, YANG Guo-ping
(Department of Oral Mdicine College of Stomatology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510080, China)
Abstract: 【Objective】 To examine the expression of Streptococcus mutans pac gene A region in attenuated Salmonella typhimurium. 【Method】 SDS-PAGE and Western blot were used to detect the new protein band and its antigenic property in Salmonella typhimurium SL3261. 【Result】 There was a 35 ku new protein band showed in SDS-PAGE and specific reaction band also showed in Western blot band. 【Conclusion】 The new expression products of recombinant Salmonella typhimurium SL3261 had antigenic property.
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Key words： Streptococcus mutans; Salmonella typhimurium; surface protein PAc
变形链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)被认为与龋病的发生、发展密切相关，是主要致龋菌[1]。变形链球菌的表面有多种细胞表面多聚物，例如壁相关蛋白、血清特异性抗原、壁磷脂酸以及肽聚糖等[2]。在这些多聚物中，一种190 ku的细胞表面蛋白抗原(曾被称为AgⅠ/Ⅱ, B, IF, P1, SR, MSL-1或PAc[3]，在本论文中用PAc专门指称这种蛋白)被认为是介导变形链球菌与牙齿表面获得性膜结合的重要成分之一。龋病的免疫学研究始于20世纪70年代，开始的研究是用变形链球菌灭活全菌注射或口服进行免疫防龋，以后的研究尝试了变形链球菌的毒力抗原成分如表面蛋白PAc，葡糖基转移酶(GTF)，根据毒力成分合成的多肽片段等多种途径。随着粘膜免疫学研究的进展，Michalek[4]等的研究发现，唾液中的SIgA是免疫防龋的关键因素，有效的提高唾液中针对变形链球菌毒力因子的特异性SIgA抗体的滴度(含量)能够达到防龋的效果。实验证明，以减毒伤寒沙门氏菌携带外源抗原进入机体后，能激发机体产生针对沙门氏载体菌和外源抗原的体液免疫，细胞免疫和粘膜免疫。本实验选用变形链球菌表面蛋白pac基因上的A区序列作为目的基因片段构建的表达质粒pET-17b/A在大肠杆菌中克隆后转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌中表达，用Western blot检测转化后减毒鼠伤寒沙门氏菌中目的基因的表达和表达产物的免疫学活性。
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1 材料与方法
1.1 菌种与质粒
pET-17b/A质粒(4.2 kb, Ampr)由本研究构建(构建过程另文发表), S. typhimurium LB5000、S. typhimurium SL3261 复旦大学任大明教授、黄建生博士赠送。
1.2 主要试剂
试剂均购自华美生物工程公司，兔抗PAc抗血清由University of Alabama at Birmingham的Dr Russell赠送，羊抗兔IgG(HRP标记)为北京中山生物技术公司产品，显色底物Western blot显色试剂盒为ECL公司产品，SDS-PAGE标准分子质量蛋白购自宝泰克公司。
1.3 质粒pET-17b/A的提取与纯化
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应用Qiaprep plasmid minprep kit进行，操作按厂家提供的说明书进行。
1.4 S. typhimurium LB5000, SL3261感受态细胞的制备
氯化钙法，参照参考文献进行[9]。
1.5 转 化
将pET-17b/A顺序转化S. typhimurium LB5000、 SL3261后，以LB-Amp琼脂平板为选择性培养基，质粒小剂量快速抽提进行重组子的挑选，含pET-17b/A质粒的S. typhimurium即为重组减毒鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗SL3261(pET-17b/A)。直接从SL3261(pET-17b/A)菌中抽提质粒DNA，经BamHⅠ,EcoRⅤ双酶切后经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，紫外灯下观察电泳结果，照像记录。
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1.6 pET-17b/A在SL3261中的表达
常规培养细菌S. typhimurium SL3261(pET-17b/A)，将待测的细菌培养至A460=0.6左右时，5 mL菌体2 000 r/min离心收集菌体，生理盐水洗涤菌体一次后，用0.1 mL PBS重悬菌体，立即加入2×SDS上样缓冲液，室温裂解5 min后，100 ℃加热5 min，冷却后上样进行SDS-PAGE电泳。
1.7 Western Blot
SDS-PAGE电泳完成后，切出含待转移蛋白的凝胶。电转移蛋白到硝酸纤维素膜，进行Western杂交。将ECL免疫荧光显色试剂盒中的1号液，2号液等量混合，取0.5 mL滴加在硝酸纤维素膜上，室温反应5 min，去除反应液。将膜与X线胶片在暗盒中曝光10 min(室温)，X线胶片常规显影及定影。
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2 结 果
2.1 S. typhimurum SL3261(pET-17b/A)中质粒DNA的鉴定
经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见从SL3261(pET-17b/A)中抽提的质粒DNA与对照质粒DNA大小一致(图1)。从S. typhimurum SL3261(pET-17b/A)中提取的质粒DNA经BamHⅠ, EcoRⅤ双酶切后，获得3.2 kb、 950 bp的两片段(图2)。说明质粒pET-17b/A已成功地转化入S. typhimurium SL3261中。
图1 鼠伤寒沙门氏菌SL3261转化子的质粒抽提结果
Fig.1 Plasmid extraction results from
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S. typhimirium SL3261
Lane 1～8: Plasmid extraction from S. typhimirium SL3261pET-17b/A; Lane 9: Marker λDNA/HindⅢ
2.2 pET-17b/A在S. typhimurium SL3261中的表达
SDS-PAGE电泳显示pET-17b/A在S. typhimurium SL3261中有较强的表达，有新蛋白的产生，分子质量约为35 ku，与预期分子量一致(图3)。
2.3 pET-17b/A表达蛋白的免疫原性分析
Western blot结果显示，在35.0 ku处位置上有相应的显色条带(图4)。初步说明S. typhimurium SL3261(pET-17b/A)中表达的变形链球菌表面蛋白A区片段具有抗原性，能与抗表面蛋白PAc的多抗反应。
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图2 鼠伤寒沙门氏菌SL3261转化子质粒抽提后EcoRⅤ、BamHⅠ双酶切结果
Fig.2 Plasmid extraction from S. typhimirium SL3261cut by EcoRⅤ,BamHⅠ
Lane 2: pET-17b/A cut by EcoRⅤ, BamHⅠ; Lane 1: Marker λDNA/HindⅢ
图3 鼠伤寒沙门氏菌SL3261(pET-17b/A)株SDS-PAGE电泳结果
Fig.3 S. typhimirium SL3261 (pET-17b/A) SDS-PAGE
Lane 1：Marker；Lane 2～4, 6：S. typhimirium SL3261 (pET-17b/A)； Lane 5：S. typhimirium SL3261
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3 讨 论
许多人类病原入侵的门户是通过粘膜感染，其中胃肠道和呼吸道疾病是影响人类健康的最常见传染病。龋病的自然免疫过程属于粘膜免疫。鉴于口服减毒活疫苗类似自然感染途径，有利于诱发大量SIgA产生，利用基因工程技术来生产各种口服疫苗已成为研究的热点。用作重组疫苗的载体主要包括：①各种病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒等以及各种无害的细菌，如乳链球菌、双岐杆菌等。②各种减毒致病菌，如减毒沙门氏菌等。减毒的鼠伤寒沙门氏菌，能有效地携带异源抗原经口侵入宿主粘膜免疫系统，激发宿主产生抗该异源抗原局部的和全身性的免疫应答，特别是产生特异性的SIgA[5]。由于减毒鼠伤寒沙门氏菌是一个粘膜免疫的有效载体，而被应用于细菌、病毒、寄生虫等疫苗的研制，已有的研究包括龋病疫苗、疟疾疾病、淋病疫苗、乙肝疫苗和爱滋病疫苗等[6]。
, http://www.100md.com 图4 鼠伤寒沙门氏菌SL3261(pET-17b/A)株
Western杂交结果Fig.4 Western blot of S.typhimirium SL3261(pET-17b/A)
Lane 1: Marker; Lane 2～4, 6: S. typhimirium SL3261 (pET-17b/A); Lane 5: S. typhimirium SL3261
用减毒的鼠伤寒沙门氏菌作为载体构建的活菌苗，在小鼠、牛、猪等动物甚至人体内的实验证明是安全有效的。目前已进行广泛实验研究的减毒株有：gal E突变株、aro和pur突变株、cya和crp缺陷株、质粒消除株、链霉素依赖实验突变株等。其中aro突变株的研究进行得较为彻底，应用广泛。由Stocker等构建的S. typhimurium SL3261 是aro突变株，作为载体已进行了多种外源基因的表达和免疫学研究。已进行的研究包括利用S. typhimurium SL3261进行淋球菌疫苗、疟原虫疫苗等的研究工作，证明是一种有效的，可靠的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗载体[7，8]。
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结合本实验的要求，选用了pET-17b质粒构建质粒载体表达系统，进行变形链球菌表面蛋白PAc的A区片段在S. typhimurium SL3261中表达研究。通过实验已成功的将重组表达质粒pET-17b/A转化入S. typhimurium SL3261中。外源性抗原基因在减毒鼠伤害沙门氏菌中必须能够高效、稳定地表达，并且要求表达的产物应具有相应的免疫活性，才能达到构建疫苗的目的。变形链球菌表面蛋白PAc的A区片段在减毒鼠伤寒沙门氏菌中表达后是否具有免疫学和生物学活性及活性高低是决定其是否具有实用价值的关键。本实验对表达质粒pET-17b/A在S. typhimurium SL 3261中的表达产物，用Dr. Russell提供的抗PAc标准抗血清进行了Western Blot检测，结果显示表达质粒pET-17b/A在S. typhimurium SL3261中表达的变形链球菌表面蛋白PAc的A区片段能与抗PAc抗血清反应，具有抗原性，为进一步研究变形链球菌基因载体疫苗的粘膜免疫打下了基础。
基金项目：广东省自然科学基金资助项目(970105)
, 百拇医药
作者简介：陈 罕(1967-)，男，江苏扬州人，博士，讲师，研究方向：龋病病因学.
参考文献：
[1] Loesche W J. Role of Streptococcus mutans in human dental decay[J]. Mirobiol Rev, 1986, 50(2): 353～380.
[2] Hamada S, Slade H. Biology, immunology, and cariogenicity of Streptococcus mutans[J]. Microbiol Rev, 1980, 44(3): 331.
[3] Okahashi N, Sasakawa C, Yoshikawa M, et al. Molecular characterization of a surface protein antigen gene from serotype c Streptococcus mutans. Implicated in dental caries[J]. Mol Microbiol, 1989, 3(2): 673.
, 百拇医药
[4] Walker R I. New strategies for using mucosal vaccination to achieve more effective immunization[J]. Vaccine, 1994, 12(2): 387.
[5] Chatfield S. The development of oral vaccines based on live attenuated Salmonella strains[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 1993, 7(1): 1.
[6] 黄建生，李全贞，王昌才,等. 恶性疟原虫抗原基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及免疫原性的初步鉴定[J]. 寄生虫与原学昆虫学报，1995, 2(3)：129.
[7] 吴 卫，林元凯，谢匡成. 淋球菌重组与减毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗口服免疫的初步研究[J]. 上海免疫学杂志，1998, 18(2)：71.
[8] Galan J E, Nakayama K, Curtiss R. Cloning and characterization of the asd gene of salmonella typhimurium: use in stable maintenance of recombinant plasmids in salmonella vaccine strains[J]. Gene, 1990, 94(1): 29.
[9] 卢圣栋. 现代分子生物学技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 1993. 258～260.
收稿日期：2000-03-20, 百拇医药
单位：中山医科大学口腔医学院口腔内科, 广东 广州 510060
关键词：变形链球菌；沙门氏菌；鼠伤寒；表面蛋白Pac
00zk19摘 要：【目的】 检测携带变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段的重组质粒pET-17b/A在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261的表达情况。【方法】 应用SDS-PAGE技术检测重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中是否有新的蛋白条带，Western blot检测条带的抗原性。【结果】 SDS-PAGE显示重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中有35 ku的新蛋白条带，Western blot显示在相应的位置上有特异的条带。【结论】 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261表达的变形链球菌表面蛋白pac基因A区片段具有抗原性。
中图分类号： R378.1； R781.1 文献标识码： A
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文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0068-04
A in Expression of Streptococcus mutans pac Gene Region
Attenuated Salmonella typhimurium
CHEN Han, LING Jun-qi, YANG Guo-ping
(Department of Oral Mdicine College of Stomatology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510080, China)
Abstract: 【Objective】 To examine the expression of Streptococcus mutans pac gene A region in attenuated Salmonella typhimurium. 【Method】 SDS-PAGE and Western blot were used to detect the new protein band and its antigenic property in Salmonella typhimurium SL3261. 【Result】 There was a 35 ku new protein band showed in SDS-PAGE and specific reaction band also showed in Western blot band. 【Conclusion】 The new expression products of recombinant Salmonella typhimurium SL3261 had antigenic property.
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Key words： Streptococcus mutans; Salmonella typhimurium; surface protein PAc
变形链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)被认为与龋病的发生、发展密切相关，是主要致龋菌[1]。变形链球菌的表面有多种细胞表面多聚物，例如壁相关蛋白、血清特异性抗原、壁磷脂酸以及肽聚糖等[2]。在这些多聚物中，一种190 ku的细胞表面蛋白抗原(曾被称为AgⅠ/Ⅱ, B, IF, P1, SR, MSL-1或PAc[3]，在本论文中用PAc专门指称这种蛋白)被认为是介导变形链球菌与牙齿表面获得性膜结合的重要成分之一。龋病的免疫学研究始于20世纪70年代，开始的研究是用变形链球菌灭活全菌注射或口服进行免疫防龋，以后的研究尝试了变形链球菌的毒力抗原成分如表面蛋白PAc，葡糖基转移酶(GTF)，根据毒力成分合成的多肽片段等多种途径。随着粘膜免疫学研究的进展，Michalek[4]等的研究发现，唾液中的SIgA是免疫防龋的关键因素，有效的提高唾液中针对变形链球菌毒力因子的特异性SIgA抗体的滴度(含量)能够达到防龋的效果。实验证明，以减毒伤寒沙门氏菌携带外源抗原进入机体后，能激发机体产生针对沙门氏载体菌和外源抗原的体液免疫，细胞免疫和粘膜免疫。本实验选用变形链球菌表面蛋白pac基因上的A区序列作为目的基因片段构建的表达质粒pET-17b/A在大肠杆菌中克隆后转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌中表达，用Western blot检测转化后减毒鼠伤寒沙门氏菌中目的基因的表达和表达产物的免疫学活性。
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1 材料与方法
1.1 菌种与质粒
pET-17b/A质粒(4.2 kb, Ampr)由本研究构建(构建过程另文发表), S. typhimurium LB5000、S. typhimurium SL3261 复旦大学任大明教授、黄建生博士赠送。
1.2 主要试剂
试剂均购自华美生物工程公司，兔抗PAc抗血清由University of Alabama at Birmingham的Dr Russell赠送，羊抗兔IgG(HRP标记)为北京中山生物技术公司产品，显色底物Western blot显色试剂盒为ECL公司产品，SDS-PAGE标准分子质量蛋白购自宝泰克公司。
1.3 质粒pET-17b/A的提取与纯化
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应用Qiaprep plasmid minprep kit进行，操作按厂家提供的说明书进行。
1.4 S. typhimurium LB5000, SL3261感受态细胞的制备
氯化钙法，参照参考文献进行[9]。
1.5 转 化
将pET-17b/A顺序转化S. typhimurium LB5000、 SL3261后，以LB-Amp琼脂平板为选择性培养基，质粒小剂量快速抽提进行重组子的挑选，含pET-17b/A质粒的S. typhimurium即为重组减毒鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗SL3261(pET-17b/A)。直接从SL3261(pET-17b/A)菌中抽提质粒DNA，经BamHⅠ,EcoRⅤ双酶切后经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，紫外灯下观察电泳结果，照像记录。
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1.6 pET-17b/A在SL3261中的表达
常规培养细菌S. typhimurium SL3261(pET-17b/A)，将待测的细菌培养至A460=0.6左右时，5 mL菌体2 000 r/min离心收集菌体，生理盐水洗涤菌体一次后，用0.1 mL PBS重悬菌体，立即加入2×SDS上样缓冲液，室温裂解5 min后，100 ℃加热5 min，冷却后上样进行SDS-PAGE电泳。
1.7 Western Blot
SDS-PAGE电泳完成后，切出含待转移蛋白的凝胶。电转移蛋白到硝酸纤维素膜，进行Western杂交。将ECL免疫荧光显色试剂盒中的1号液，2号液等量混合，取0.5 mL滴加在硝酸纤维素膜上，室温反应5 min，去除反应液。将膜与X线胶片在暗盒中曝光10 min(室温)，X线胶片常规显影及定影。
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2 结 果
2.1 S. typhimurum SL3261(pET-17b/A)中质粒DNA的鉴定
经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见从SL3261(pET-17b/A)中抽提的质粒DNA与对照质粒DNA大小一致(图1)。从S. typhimurum SL3261(pET-17b/A)中提取的质粒DNA经BamHⅠ, EcoRⅤ双酶切后，获得3.2 kb、 950 bp的两片段(图2)。说明质粒pET-17b/A已成功地转化入S. typhimurium SL3261中。
图1 鼠伤寒沙门氏菌SL3261转化子的质粒抽提结果
Fig.1 Plasmid extraction results from
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S. typhimirium SL3261
Lane 1～8: Plasmid extraction from S. typhimirium SL3261pET-17b/A; Lane 9: Marker λDNA/HindⅢ
2.2 pET-17b/A在S. typhimurium SL3261中的表达
SDS-PAGE电泳显示pET-17b/A在S. typhimurium SL3261中有较强的表达，有新蛋白的产生，分子质量约为35 ku，与预期分子量一致(图3)。
2.3 pET-17b/A表达蛋白的免疫原性分析
Western blot结果显示，在35.0 ku处位置上有相应的显色条带(图4)。初步说明S. typhimurium SL3261(pET-17b/A)中表达的变形链球菌表面蛋白A区片段具有抗原性，能与抗表面蛋白PAc的多抗反应。
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图2 鼠伤寒沙门氏菌SL3261转化子质粒抽提后EcoRⅤ、BamHⅠ双酶切结果
Fig.2 Plasmid extraction from S. typhimirium SL3261cut by EcoRⅤ,BamHⅠ
Lane 2: pET-17b/A cut by EcoRⅤ, BamHⅠ; Lane 1: Marker λDNA/HindⅢ
图3 鼠伤寒沙门氏菌SL3261(pET-17b/A)株SDS-PAGE电泳结果
Fig.3 S. typhimirium SL3261 (pET-17b/A) SDS-PAGE
Lane 1：Marker；Lane 2～4, 6：S. typhimirium SL3261 (pET-17b/A)； Lane 5：S. typhimirium SL3261
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3 讨 论
许多人类病原入侵的门户是通过粘膜感染，其中胃肠道和呼吸道疾病是影响人类健康的最常见传染病。龋病的自然免疫过程属于粘膜免疫。鉴于口服减毒活疫苗类似自然感染途径，有利于诱发大量SIgA产生，利用基因工程技术来生产各种口服疫苗已成为研究的热点。用作重组疫苗的载体主要包括：①各种病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒等以及各种无害的细菌，如乳链球菌、双岐杆菌等。②各种减毒致病菌，如减毒沙门氏菌等。减毒的鼠伤寒沙门氏菌，能有效地携带异源抗原经口侵入宿主粘膜免疫系统，激发宿主产生抗该异源抗原局部的和全身性的免疫应答，特别是产生特异性的SIgA[5]。由于减毒鼠伤寒沙门氏菌是一个粘膜免疫的有效载体，而被应用于细菌、病毒、寄生虫等疫苗的研制，已有的研究包括龋病疫苗、疟疾疾病、淋病疫苗、乙肝疫苗和爱滋病疫苗等[6]。
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Western杂交结果Fig.4 Western blot of S.typhimirium SL3261(pET-17b/A)
Lane 1: Marker; Lane 2～4, 6: S. typhimirium SL3261 (pET-17b/A); Lane 5: S. typhimirium SL3261
用减毒的鼠伤寒沙门氏菌作为载体构建的活菌苗，在小鼠、牛、猪等动物甚至人体内的实验证明是安全有效的。目前已进行广泛实验研究的减毒株有：gal E突变株、aro和pur突变株、cya和crp缺陷株、质粒消除株、链霉素依赖实验突变株等。其中aro突变株的研究进行得较为彻底，应用广泛。由Stocker等构建的S. typhimurium SL3261 是aro突变株，作为载体已进行了多种外源基因的表达和免疫学研究。已进行的研究包括利用S. typhimurium SL3261进行淋球菌疫苗、疟原虫疫苗等的研究工作，证明是一种有效的，可靠的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗载体[7，8]。
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结合本实验的要求，选用了pET-17b质粒构建质粒载体表达系统，进行变形链球菌表面蛋白PAc的A区片段在S. typhimurium SL3261中表达研究。通过实验已成功的将重组表达质粒pET-17b/A转化入S. typhimurium SL3261中。外源性抗原基因在减毒鼠伤害沙门氏菌中必须能够高效、稳定地表达，并且要求表达的产物应具有相应的免疫活性，才能达到构建疫苗的目的。变形链球菌表面蛋白PAc的A区片段在减毒鼠伤寒沙门氏菌中表达后是否具有免疫学和生物学活性及活性高低是决定其是否具有实用价值的关键。本实验对表达质粒pET-17b/A在S. typhimurium SL 3261中的表达产物，用Dr. Russell提供的抗PAc标准抗血清进行了Western Blot检测，结果显示表达质粒pET-17b/A在S. typhimurium SL3261中表达的变形链球菌表面蛋白PAc的A区片段能与抗PAc抗血清反应，具有抗原性，为进一步研究变形链球菌基因载体疫苗的粘膜免疫打下了基础。
基金项目：广东省自然科学基金资助项目(970105)
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作者简介：陈 罕(1967-)，男，江苏扬州人，博士，讲师，研究方向：龋病病因学.
参考文献：
[1] Loesche W J. Role of Streptococcus mutans in human dental decay[J]. Mirobiol Rev, 1986, 50(2): 353～380.
[2] Hamada S, Slade H. Biology, immunology, and cariogenicity of Streptococcus mutans[J]. Microbiol Rev, 1980, 44(3): 331.
[3] Okahashi N, Sasakawa C, Yoshikawa M, et al. Molecular characterization of a surface protein antigen gene from serotype c Streptococcus mutans. Implicated in dental caries[J]. Mol Microbiol, 1989, 3(2): 673.
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[4] Walker R I. New strategies for using mucosal vaccination to achieve more effective immunization[J]. Vaccine, 1994, 12(2): 387.
[5] Chatfield S. The development of oral vaccines based on live attenuated Salmonella strains[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 1993, 7(1): 1.
[6] 黄建生，李全贞，王昌才,等. 恶性疟原虫抗原基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及免疫原性的初步鉴定[J]. 寄生虫与原学昆虫学报，1995, 2(3)：129.
[7] 吴 卫，林元凯，谢匡成. 淋球菌重组与减毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗口服免疫的初步研究[J]. 上海免疫学杂志，1998, 18(2)：71.
[8] Galan J E, Nakayama K, Curtiss R. Cloning and characterization of the asd gene of salmonella typhimurium: use in stable maintenance of recombinant plasmids in salmonella vaccine strains[J]. Gene, 1990, 94(1): 29.
[9] 卢圣栋. 现代分子生物学技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 1993. 258～260.
收稿日期：2000-03-20, 百拇医药