不同深度的Ⅱ度烧伤创面中单核巨噬细胞生长因子的mRNA表达
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作者：方培耀 程枫 冯世杰 赵涵芳 章有章 史济湘
单位：方培耀 冯世杰 史济湘 200025 上海第二医科大学附属瑞金医院烧伤整形科；程枫 赵涵芳 章有章 上海第二医科大学生化教研组
关键词：灼伤；生长因子；mRNA表达
中华创伤杂志980605 【摘要】 目的 了解不同深度的Ⅱ度烧伤创面内源性生长因子的表达调控特点,以及这些特点与创面愈合过程的关系。方法 分别观察大鼠浅Ⅱ度和深Ⅱ度烫伤模型创面渗液单核巨噬细胞生长因子mRNA表达的变化,并比较分析了两者间的差异。这些生长因子有TGFα、TGFβ和PDGF。结果 对照组、浅Ⅱ度和深Ⅱ度组实验动物的创面单核巨噬细胞mRNA表达明显不同。未烫伤的对照组(单纯植海绵收集创面渗液)伤后1天均达峰值以后呈持续下降;浅Ⅱ度组伤后1周呈更高而持续的表达,伤后2周时回落接近对照组;深Ⅱ度组伤后早期呈低水平表达,于伤后1周时呈较高水平表达,其中TGFβ迟至伤后2周呈较高水平表达。结论 提示创面单河巨噬细胞生长因子表达的启动,达到高峰和回落与损伤类型和创面愈合的状况密切有关,深Ⅱ度创面早期单核巨噬细胞生长因子的低水平表达与这类创面愈合时间较长的关系值得深入探讨。
, 百拇医药
Study of mRNA Expression of Growth Factors in Mononuclear Macrophages from Superficial and Deep Ⅱ Degree Burn Wounds in Rats FANG Pei-yao, CHENG Feng, FENG Shi-jie, et al. Dept. of Burn and Plastic Surgery, Ruijin Hospital, Second Medical University, Shanghai 200025
【Abstract】 Aim To investigate the characteristics of the expression of growth factors in superficial and deepⅡ degree burn wounds and their relationship to burn wound healing. Methods With rat burn models, we observed the changes of mRNA expression of growth factors in mononuclear macrophages from superficial and deep second degree burn wounds by in situ hybridization. The growth factors included TGFα, TGFβ and PDGF. Results There were remarkable difference between the control groups, the superficial Ⅱ degree burn group and the deep Ⅱ degree burn group. In controls, mRNA expression of growth factors reached peak 1 day post injury (implanting sponge for collecting exudates ) and gradually decreased to low level at 14 days post injury. In the superficial Ⅱ degree burn group, mRNA expression of growth factors had higher level than that of the controls and it maintained about 1 week postburn and decreased to low level 14 days postburn. In the deep Ⅱ degree burns the expression of growth factors was lower than that of the controls during 1 week postburn and reached peak only at 7 days and 14 days postburn especially TGFβ which reached peak only at 14 days postburn. Conclusion It is indicated that mRNA expression of growth factors in mononuclear macrophages is relative to the types of injury and the time-course of wound healing. It needs further exploration for the relationship between delayed healing of deep Ⅱ degree burns and low level of mRNA expression of growth factors in mononuclear macrophages.
, 百拇医药
【Key words】 Burn Growth factor mRNA expression
烧伤Ⅱ度创面可根据皮肤损伤深度再分为浅Ⅱ度和深Ⅱ度。前者可较快达到再上皮化而愈合;后者愈合时间明显延长。一般认为,深Ⅱ度创面愈合时间较长与损伤累及真皮层、创面早期进行性加深和依赖残存皮肤附件上皮增殖的程度以达到再上皮化等病理因素有关[1]。对这类创面愈合过程中至为关键的生长因子调控的作用迄今了解较少。
近年来许多研究表明,创面愈合过程中的生长因子从基因表达到细胞蛋白质水平的变化甚为复杂[2]。细胞调节这些复杂变化的关键之一是mRNA表达。mRNA变化虽然不能绝对反映蛋白质的变化,却是生长因子基因开放、激活的第一步[3]。又由于单核巨噬细胞是创面愈合重要的细胞组份之一,它的数量与功能的变化直接影响创面愈合[4]。因此,为了解烧伤Ⅱ度创面的深度对单核巨噬细胞生长因子mRNA的影响,探讨这些影响与创面愈合方式及时间之间的关系,笔者分别在大鼠浅Ⅱ度和深Ⅱ度烫伤模型观察了创面渗液单核巨噬细胞生长因子mRNA表达的变化,并比较分析了两者间的差异,以期为临床从应用生长因子调控途径加速创面愈合提供依据。
, 百拇医药
材料与方法
1.烧伤动物模型制作。清洁级SD大鼠180只,雌雄不限,体重200～250g。实验前1日腹腔注射2.5%戊巴比妥钠溶液(35mg/kg体重)麻醉,背部剪毛再以40%硫化钡复合制剂脱毛。烫伤前再按前法麻醉后,于背部双侧后方各行一1cm长切口,皮下崐分离后埋入丙酮和酒精处理和γ射线辐射灭菌的聚氨酯海绵(1.5cm×1.0cm×0.5cm),切口缝合。大鼠再分为以下三组:组1,为未烫伤组(对照组);组2,为浅Ⅱ度烫伤组;组3,为深Ⅱ度烫伤组。烫伤方法为背部浸浴于电热恒温水浴锅,面积10%。浅Ⅱ度致伤条件为70℃水温8秒;深Ⅱ度为80℃水温5秒。伤后均经病理切片镜检证实致伤深度。动物均分笼饲养,常规进食,自由进水。
2.单核巨噬细胞生长因子mRNA表达检测。各组动物均取6或3只在伤后1,3,7,14天于麻醉无菌条件下取出植入海绵,挤压收集渗液,离心后沉淀细胞用于生长因子mRNA表达检测。分离单核巨噬细胞后涂片,经预杂交,以DIG-11-ddUTP标记的3种DNA探针(PDGF、TGFα和TGFβ)杂交、洗脱未杂交探针,洗涤、显色后,以油镜镜检500个单个核细胞。凡胞浆有碱性磷酸酶标记免疫紫色颗粒者为阳性细胞。
, 百拇医药
3.数据统计学处理。实验所得数据均以
±s表示,用t检验比较组间差异,P<0.05者为显著性差异。
结 果
三组实验动物的创面单核巨噬细胞mRNA表达明显不同(附表)。未烫伤组三种因子mRNA表达伤后1天均达峰值,以后呈进行性下降直到伤后14天达很低的表达水平。浅Ⅱ度烫伤组呈现较未烫伤组更为增高并持续约1周的高水平表达,伤后14天达较低水平的表达。深Ⅱ度烫伤组表现为早期低水平表达和伤后7,14天较低水平的表达,这种变化似乎以TGFβ和PDGF最为显著。前者伤后14天出现峰值,而此时TGFα和PDGF已有回落趋势。
附表 大鼠Ⅱ度烫伤创面单核巨噬细胞三种生长因子mRNA表达的动态观察(±s) 组别
, 百拇医药
生长因子
鼠数
伤后时间(d)
1
3
7
14
未烫伤组
TGFα
6
251±47△
239±49
141±36
, 百拇医药
24±10
TGFβ
6
242±22
192±28
113±26
19±2
PDGF
6
228±37
106±25
73±23
18±8
, 百拇医药
浅Ⅱ度组
TGFα
6
381±53***
400±53***
388±105***
97±21**
TGFβ
6
273±16***
226±20***
, 百拇医药
243±33***
19±6
PDGF
6
428±30***
486±9***
274±17***
73±31***
深Ⅱ度组
TGFα
3
, 百拇医药
164±14***
188±11***
279±14***
188±46***
TGFβ
3
-
48±23***
44±26***
180±28***
, http://www.100md.com PDGF
3
87±8***
-
249±21***
142±50***
注:△500个受检细胞中的阳性细胞个数;与未烫伤组比较:**P<0.01 ***P<0.001
讨 论
长期以来,关于浅Ⅱ度和深Ⅱ度创面愈合在时间和方式上的差异一直归属于病理解剖学方面的差异。对二者在病理生理学方面的差异了解较少,如这两类创面的炎症反应过程,各种不同细胞的增殖速率,再上皮化后的组织重建过程等方面的特点与区别。尤其是关于这两类创面的生长因子表达调控方式有何区别,尚知之不多。由于近年来关于生长因子外源性应用已成为烧伤创面治疗的热点课题,因此,了解上述区别,针对性地应用外源性生长因子以促使创面健存细胞加速增殖,并有的放矢地考察应用生长因子对加速创面愈合的有效性,必须首先了解创面内源性生长因子的表达调控特点。笔者正是为此目的,从创面单核巨噬细胞生长因子mRNA表达这一关键着手,探讨了创面内源性生长因子表达的特点与规律性。
, 百拇医药
实验结果提示,三组动物遭受创伤类型的不同,可以导致创面单核巨噬细胞生长因子mRNA表达的差异。未烫伤组动物实际上是切口伤,而浅Ⅱ度和深Ⅱ度组动物除了切口伤,又遭受了不同程度的烫伤。两种深度的烫伤与未烫伤组比较,浅Ⅱ度组出现更高而持续的生长因子表达,伤后14天创面愈合回落至较低水平接近未烫伤组;而深Ⅱ度组则出现早期低水平,伤后1周呈较高水平的表达,伤后14天创面尚未完全愈合而仍处于较高水平的表达。同时,深Ⅱ度组三种因子表达高峰的出现顺序亦有明显的特点。这些现象进一步提示,烫伤创面愈合过程较切口伤更为复杂,有关生长因子表达似乎受控于更多的未知因素。深Ⅱ度创面愈合时间较长,是否与早期炎症反应较重而且持续时间较长导致生长因子低水平表达和峰值表达延迟有关,值得进一步探讨。
实验结果提示的另一个有意义的现象,是深Ⅱ度创面中单核巨噬细胞TGFβ mRNA低水平表达和峰值明显推迟。已知TGFβ可能是所有生长因子中作用最高的一类,且几乎所有细胞都有TGFβ受体。TGFβ有双向生物学效应,既促进亦抑制细胞的增殖与分化[2，5]。TGFβ还可作为免疫抑制物质调节炎症反应。具有如此广泛生物效应的生长因子,在深Ⅱ度创面单核巨噬细胞 mRNA表达中如此迟缓,不能不认为这一现象有更为深刻的病理生理学意义,有待深入研究阐明。
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本次实验结果还提示,生长因子表达的启动,达到高峰和回落与损伤类型和创面愈合状况密切有关。机体对创伤修复有很强的适应与调控能力。究竟机体和创面的哪些因素对单核巨噬细胞生长因子表达起“开关”和调节作用能否解除抑制表达的因素使内源性生长因子合成并释放,同时从转录—蛋白质表达—受体结合各层次予以调控,促进深度创面的愈合抑或伤后早期针对性给予体内低水平表达的生长因子如PDGF等,以尽早启动创面的愈合过程,加速深度创面的愈合这些问题尚待深入系统的研究予以回答。
参考文献
[1]陈意生,史景泉,梁延杰.烧伤的病理形态学改变.见:黎鳌主编.烧伤治疗学.北京:人民卫生出版社, 1995, 17-21.
[2]Steed DL. The role of growth factors in wound healing. Surg Clin North Am, 1997, 77∶575-586.
[3]程枫,赵涵芳,章有章,等.大鼠浅Ⅱ度烧伤创面渗液细胞原位杂交生长因子mRNA表达.上海第二医科大学学报,1997, 17(S)∶10-12.
[4]Dipietro LA. Wound healing: The role of the macrophage and other immune cells. Shock, 1995, 4∶233-240.
[5]史济湘.创伤愈合与有关细胞生长因子.上海第二医科大学学报, 1997, 17(S)∶82-85.
(收稿:1998-10-16), 百拇医药
单位：方培耀 冯世杰 史济湘 200025 上海第二医科大学附属瑞金医院烧伤整形科；程枫 赵涵芳 章有章 上海第二医科大学生化教研组
关键词：灼伤；生长因子；mRNA表达
中华创伤杂志980605 【摘要】 目的 了解不同深度的Ⅱ度烧伤创面内源性生长因子的表达调控特点,以及这些特点与创面愈合过程的关系。方法 分别观察大鼠浅Ⅱ度和深Ⅱ度烫伤模型创面渗液单核巨噬细胞生长因子mRNA表达的变化,并比较分析了两者间的差异。这些生长因子有TGFα、TGFβ和PDGF。结果 对照组、浅Ⅱ度和深Ⅱ度组实验动物的创面单核巨噬细胞mRNA表达明显不同。未烫伤的对照组(单纯植海绵收集创面渗液)伤后1天均达峰值以后呈持续下降;浅Ⅱ度组伤后1周呈更高而持续的表达,伤后2周时回落接近对照组;深Ⅱ度组伤后早期呈低水平表达,于伤后1周时呈较高水平表达,其中TGFβ迟至伤后2周呈较高水平表达。结论 提示创面单河巨噬细胞生长因子表达的启动,达到高峰和回落与损伤类型和创面愈合的状况密切有关,深Ⅱ度创面早期单核巨噬细胞生长因子的低水平表达与这类创面愈合时间较长的关系值得深入探讨。
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Study of mRNA Expression of Growth Factors in Mononuclear Macrophages from Superficial and Deep Ⅱ Degree Burn Wounds in Rats FANG Pei-yao, CHENG Feng, FENG Shi-jie, et al. Dept. of Burn and Plastic Surgery, Ruijin Hospital, Second Medical University, Shanghai 200025
【Abstract】 Aim To investigate the characteristics of the expression of growth factors in superficial and deepⅡ degree burn wounds and their relationship to burn wound healing. Methods With rat burn models, we observed the changes of mRNA expression of growth factors in mononuclear macrophages from superficial and deep second degree burn wounds by in situ hybridization. The growth factors included TGFα, TGFβ and PDGF. Results There were remarkable difference between the control groups, the superficial Ⅱ degree burn group and the deep Ⅱ degree burn group. In controls, mRNA expression of growth factors reached peak 1 day post injury (implanting sponge for collecting exudates ) and gradually decreased to low level at 14 days post injury. In the superficial Ⅱ degree burn group, mRNA expression of growth factors had higher level than that of the controls and it maintained about 1 week postburn and decreased to low level 14 days postburn. In the deep Ⅱ degree burns the expression of growth factors was lower than that of the controls during 1 week postburn and reached peak only at 7 days and 14 days postburn especially TGFβ which reached peak only at 14 days postburn. Conclusion It is indicated that mRNA expression of growth factors in mononuclear macrophages is relative to the types of injury and the time-course of wound healing. It needs further exploration for the relationship between delayed healing of deep Ⅱ degree burns and low level of mRNA expression of growth factors in mononuclear macrophages.
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【Key words】 Burn Growth factor mRNA expression
烧伤Ⅱ度创面可根据皮肤损伤深度再分为浅Ⅱ度和深Ⅱ度。前者可较快达到再上皮化而愈合;后者愈合时间明显延长。一般认为,深Ⅱ度创面愈合时间较长与损伤累及真皮层、创面早期进行性加深和依赖残存皮肤附件上皮增殖的程度以达到再上皮化等病理因素有关[1]。对这类创面愈合过程中至为关键的生长因子调控的作用迄今了解较少。
近年来许多研究表明,创面愈合过程中的生长因子从基因表达到细胞蛋白质水平的变化甚为复杂[2]。细胞调节这些复杂变化的关键之一是mRNA表达。mRNA变化虽然不能绝对反映蛋白质的变化,却是生长因子基因开放、激活的第一步[3]。又由于单核巨噬细胞是创面愈合重要的细胞组份之一,它的数量与功能的变化直接影响创面愈合[4]。因此,为了解烧伤Ⅱ度创面的深度对单核巨噬细胞生长因子mRNA的影响,探讨这些影响与创面愈合方式及时间之间的关系,笔者分别在大鼠浅Ⅱ度和深Ⅱ度烫伤模型观察了创面渗液单核巨噬细胞生长因子mRNA表达的变化,并比较分析了两者间的差异,以期为临床从应用生长因子调控途径加速创面愈合提供依据。
, 百拇医药
材料与方法
1.烧伤动物模型制作。清洁级SD大鼠180只,雌雄不限,体重200～250g。实验前1日腹腔注射2.5%戊巴比妥钠溶液(35mg/kg体重)麻醉,背部剪毛再以40%硫化钡复合制剂脱毛。烫伤前再按前法麻醉后,于背部双侧后方各行一1cm长切口,皮下崐分离后埋入丙酮和酒精处理和γ射线辐射灭菌的聚氨酯海绵(1.5cm×1.0cm×0.5cm),切口缝合。大鼠再分为以下三组:组1,为未烫伤组(对照组);组2,为浅Ⅱ度烫伤组;组3,为深Ⅱ度烫伤组。烫伤方法为背部浸浴于电热恒温水浴锅,面积10%。浅Ⅱ度致伤条件为70℃水温8秒;深Ⅱ度为80℃水温5秒。伤后均经病理切片镜检证实致伤深度。动物均分笼饲养,常规进食,自由进水。
2.单核巨噬细胞生长因子mRNA表达检测。各组动物均取6或3只在伤后1,3,7,14天于麻醉无菌条件下取出植入海绵,挤压收集渗液,离心后沉淀细胞用于生长因子mRNA表达检测。分离单核巨噬细胞后涂片,经预杂交,以DIG-11-ddUTP标记的3种DNA探针(PDGF、TGFα和TGFβ)杂交、洗脱未杂交探针,洗涤、显色后,以油镜镜检500个单个核细胞。凡胞浆有碱性磷酸酶标记免疫紫色颗粒者为阳性细胞。
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3.数据统计学处理。实验所得数据均以
±s表示,用t检验比较组间差异,P<0.05者为显著性差异。结 果
三组实验动物的创面单核巨噬细胞mRNA表达明显不同(附表)。未烫伤组三种因子mRNA表达伤后1天均达峰值,以后呈进行性下降直到伤后14天达很低的表达水平。浅Ⅱ度烫伤组呈现较未烫伤组更为增高并持续约1周的高水平表达,伤后14天达较低水平的表达。深Ⅱ度烫伤组表现为早期低水平表达和伤后7,14天较低水平的表达,这种变化似乎以TGFβ和PDGF最为显著。前者伤后14天出现峰值,而此时TGFα和PDGF已有回落趋势。
附表 大鼠Ⅱ度烫伤创面单核巨噬细胞三种生长因子mRNA表达的动态观察(
±s) 组别, 百拇医药
生长因子
鼠数
伤后时间(d)
1
3
7
14
未烫伤组
TGFα
6
251±47△
239±49
141±36
, 百拇医药
24±10
TGFβ
6
242±22
192±28
113±26
19±2
PDGF
6
228±37
106±25
73±23
18±8
, 百拇医药
浅Ⅱ度组
TGFα
6
381±53***
400±53***
388±105***
97±21**
TGFβ
6
273±16***
226±20***
, 百拇医药
243±33***
19±6
PDGF
6
428±30***
486±9***
274±17***
73±31***
深Ⅱ度组
TGFα
3
, 百拇医药
164±14***
188±11***
279±14***
188±46***
TGFβ
3
-
48±23***
44±26***
180±28***
, http://www.100md.com PDGF
3
87±8***
-
249±21***
142±50***
注:△500个受检细胞中的阳性细胞个数;与未烫伤组比较:**P<0.01 ***P<0.001
讨 论
长期以来,关于浅Ⅱ度和深Ⅱ度创面愈合在时间和方式上的差异一直归属于病理解剖学方面的差异。对二者在病理生理学方面的差异了解较少,如这两类创面的炎症反应过程,各种不同细胞的增殖速率,再上皮化后的组织重建过程等方面的特点与区别。尤其是关于这两类创面的生长因子表达调控方式有何区别,尚知之不多。由于近年来关于生长因子外源性应用已成为烧伤创面治疗的热点课题,因此,了解上述区别,针对性地应用外源性生长因子以促使创面健存细胞加速增殖,并有的放矢地考察应用生长因子对加速创面愈合的有效性,必须首先了解创面内源性生长因子的表达调控特点。笔者正是为此目的,从创面单核巨噬细胞生长因子mRNA表达这一关键着手,探讨了创面内源性生长因子表达的特点与规律性。
, 百拇医药
实验结果提示,三组动物遭受创伤类型的不同,可以导致创面单核巨噬细胞生长因子mRNA表达的差异。未烫伤组动物实际上是切口伤,而浅Ⅱ度和深Ⅱ度组动物除了切口伤,又遭受了不同程度的烫伤。两种深度的烫伤与未烫伤组比较,浅Ⅱ度组出现更高而持续的生长因子表达,伤后14天创面愈合回落至较低水平接近未烫伤组;而深Ⅱ度组则出现早期低水平,伤后1周呈较高水平的表达,伤后14天创面尚未完全愈合而仍处于较高水平的表达。同时,深Ⅱ度组三种因子表达高峰的出现顺序亦有明显的特点。这些现象进一步提示,烫伤创面愈合过程较切口伤更为复杂,有关生长因子表达似乎受控于更多的未知因素。深Ⅱ度创面愈合时间较长,是否与早期炎症反应较重而且持续时间较长导致生长因子低水平表达和峰值表达延迟有关,值得进一步探讨。
实验结果提示的另一个有意义的现象,是深Ⅱ度创面中单核巨噬细胞TGFβ mRNA低水平表达和峰值明显推迟。已知TGFβ可能是所有生长因子中作用最高的一类,且几乎所有细胞都有TGFβ受体。TGFβ有双向生物学效应,既促进亦抑制细胞的增殖与分化[2，5]。TGFβ还可作为免疫抑制物质调节炎症反应。具有如此广泛生物效应的生长因子,在深Ⅱ度创面单核巨噬细胞 mRNA表达中如此迟缓,不能不认为这一现象有更为深刻的病理生理学意义,有待深入研究阐明。
, http://www.100md.com
本次实验结果还提示,生长因子表达的启动,达到高峰和回落与损伤类型和创面愈合状况密切有关。机体对创伤修复有很强的适应与调控能力。究竟机体和创面的哪些因素对单核巨噬细胞生长因子表达起“开关”和调节作用能否解除抑制表达的因素使内源性生长因子合成并释放,同时从转录—蛋白质表达—受体结合各层次予以调控,促进深度创面的愈合抑或伤后早期针对性给予体内低水平表达的生长因子如PDGF等,以尽早启动创面的愈合过程,加速深度创面的愈合这些问题尚待深入系统的研究予以回答。
参考文献
[1]陈意生,史景泉,梁延杰.烧伤的病理形态学改变.见:黎鳌主编.烧伤治疗学.北京:人民卫生出版社, 1995, 17-21.
[2]Steed DL. The role of growth factors in wound healing. Surg Clin North Am, 1997, 77∶575-586.
[3]程枫,赵涵芳,章有章,等.大鼠浅Ⅱ度烧伤创面渗液细胞原位杂交生长因子mRNA表达.上海第二医科大学学报,1997, 17(S)∶10-12.
[4]Dipietro LA. Wound healing: The role of the macrophage and other immune cells. Shock, 1995, 4∶233-240.
[5]史济湘.创伤愈合与有关细胞生长因子.上海第二医科大学学报, 1997, 17(S)∶82-85.
(收稿:1998-10-16), 百拇医药