体外单核巨噬细胞诱生IFN-α的因素分析
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37c医学网
作者：孙路虹 姚 堃 季晓辉 丁如宁 李焕娣
单位：南京医科大学微生物学教研室 南京 210029
关键词：M-CSF；IFN-γ；IFN-α；NDV；单核细胞
免疫学杂志990212摘 要 观察了M-CSF预处理、IFN-γ预处理、长程培养及新城疫病毒(new-castle disease virus，NDV)刺激4个因素对正常人外周血单核细胞体外产生IFN-α水平的影响，采用生物活性法检测IFN-α。结果表明：单独使用M-CSF不能诱生IFN-α；单独使用IFN-γ或单独使用NDV均只诱生较低水平IFN-α，只有M-CSF+IFN-γ+NDV或IFN-γ+NDV联合使用方可诱生较高水平的IFN-α，并且发现Mο、-Mφ长程培养也是向高产发展的一个重要因素。结论：人血Mο、-Mφ在适当体外培养条件下，可以诱发较高水平的IFN-α。
, 百拇医药
中图号 R392
ANALYSIS OF FACTORS AFFECTED IFN-α INDUCTION BY HUMAN BLOOD MONOCYTES IN VITRO
Sun Luhong，Yao Kun，Ji Xiaohui，Ding Runing，Li Huandi
(Department of Microbiology，Nanjing Medical University，Nanjing 210029)
Abstract Mο-Mφ could hardly induce IFN-α in vitro，especially at high level.This paper reported 4 factors affected IFN-α induction from cultured Mο-Mφ.The results showed treatment singly with M-CSF couldnt induce IFN-α.Treatment with IFN-γ alone or stimulation with NDV alone could induce low level of IFN-α.Treatment with M-CSF，IFN-γ and NDV proved to be the best.The age of Mο-Mφ culture was also an important factor.
, 百拇医药
Key words M-CSF，IFN-γ，IFN-α，NDV，Monocyte
IFN-α的体外诱生通常用NDV或仙台病毒作用于B细胞，使之产生IFN-α，用Mο-Mφ(单核-巨噬细胞)诱生IFN-α是相当困难的。本文通过改变Mο-Mφ的培养条件，使之适于诱生IFN-α，观察了4种因素：M-CSF的预处理，IFN-γ的预处理，Mο-Mφ长程培养和NDV刺激对诱生IFN-α的影响。4种因素或单独使用或联合使用，出现许多不同的效应，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系和病毒：人羊膜WISH株按常规培养传代，用于滴定IFN-α；水泡性口炎病毒(VSV)本室低温保存，用于滴定IFN-α；NDV来自本室，用于诱生IFN-α。
, 百拇医药
1.1.2 试剂：rhM-CSF由南京大学生物系提供，比活性1.2×106CFU/mg；rhIFN-γ由上海生物制品研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 单核细胞的分离[1]：从健康人新鲜静脉血中分离单个核细胞，以1×107/ml细胞浓度加入96孔细胞培养板，每孔200μl；置37°C 5%CO2贴壁培养2h；洗3次去非粘附细胞，贴壁的即为单核细胞，每孔约有贴壁细胞0.3×105～1×105个，经非特异性酯酶染色证实所得细胞95%以上为单核细胞。
1.2.2 IFN-α的诱生：根据参考文献[2]并予改进。诱生IFN-α共用4个可变因素，即NDV(血凝效价1∶1280)20μl/孔，M-CSF(5 000U/ml)100μl/孔，IFN-γ(1 000U/ml)100μl/孔和长程培养时间。培养条件均为37°C 5%CO2。①将含有单核细胞的培养板分别培养1，3，7，12d后，加IFN-γ、M-CSF或NDV分别培养24h，收集上清；或加IFN-γ、M-CSF分别培养24h后再加NDV培养24h，收集上清，详见表1。②在含有单核细胞的培养板孔内加入M-CSF分别预处理1，3，7，12d后，加入IFN-γ、NDV分别培养24h，收集上清；或加IFN-γ培养24h再加DNV培养24h，收集上清，详见表2。所收集培养上清，均经加热56°C 30min处理，以除去IFN-γ，移置-20°C保存，备测IFN-α。
, http://www.100md.com
1.2.3 IFN-α的检测：通过细胞病变抑制试验[3]检测IFN-α活性，以能抑制CPE(++)的最高稀释度为终点。此读数为本室检测IFN-α的工作单位，而非国际标准单位。
2 结果
表1显示：单独M-CSF刺激不产生IFN-α；单独IFN-γ或单独NDV刺激，产生较低水平IFN-α；M-CSF+NDV联合刺激产生IFN-α水平也较低；只有IFN-γ+NDV联合刺激才能产生较高水平的IFN-α。此外，随着单核细胞培养时间延长，M-CSF组、IFN-γ组、NDV组和M-CSF+NDV组诱生IFN-α水平均无明显升高趋势，而IFN-γ+NDV组诱生IFN-α水平则逐渐升高，在1，3，7，12d产生IFN-α量与其它各组比均具显著性差异(P<0.01)
表1 培养不同时间后M-CSF/IFN-γ/NDV单独或联合刺激
, 百拇医药
对单核细胞诱生IFN-α的影响(n＝5)
Tab 1 IFN-α production inducing with M-CSF/IFN-γ/NDV singly
or combinedly at different age of monocyte culture(n＝5) Different age of
monocyte culture
(days)
IFN-α activity (u/0.1ml)(
±s)
Medium
, 百拇医药
M-CSF
IFN-γ
NDV
M-CSF+NDV
(NDV after 1 day
treatment of M-CSF)
IFN-γ+DNV
(NDV after 1 day
treatment of IFN-γ)
1
<2
, 百拇医药 <3
4.8±1.1
13.6±3.6
15.2±5.2
57.6±8.8
3
<2
<2
6.0±2.5
14.4±6.1
16.0±4.8
102.8±26.7
7
, 百拇医药
<2
<2
7.6±0.9
16.0±5.8
16.8±4.4
115.2±28.6
12
<2
<2
8.8±3.0
20.0±5.7
18.4±5.4
192.0±64.0
, 百拇医药
表2显示，单独用M-CSF预处理，对IFN-α几乎无诱生作用；经过M-CSF预处理再与IFN-γ或NDV联合刺激诱生作用较弱，并且不随M-CSF预处理时间延长而诱生作用增强；经M-CSF预处理再与IFN-γ和NDV联合刺激，诱生作用最强，且随着M-CSF预处理时间延长，M-CSF+IFN-γ+NDV三者联合刺激诱生IFN-α水平均逐渐升高，在1，3，7，12d诱生IFN-α水平的量与其它各组比较均具有显著性差异(P<0.01)。表2 M-CSF预处理不同时间后加刺激剂(IFN-γ/NDV)对单核细胞诱生IFN-α的影响(n＝5)
Tab 2 IFN-α produced by monocyte after pretreatment of M-CSF，then stimulated by IFN-γ/NDV(n＝5) Duration of M-CSF
pre-treatment
, 百拇医药 (days)
IFN-α activity (u/0.1ml)(±s)
Medium
(with M-CSF)
IFN-γ
NDV
IFN-γ+NDV
(NDV after 1 day treatment of IFN-γ)
1
<2
, http://www.100md.com
6.4±2.0
16.0±5.6
76.8±17.5
3
<2
8.4±2.1
18.4±5.4
121.6±41.7
7
<2
8.8±1.8
20.0±8.0
, http://www.100md.com 128.0±39.1
12
<2
9.6±2.2
25.6±8.7
204.0±28.6
3 讨论
Mο-Mφ系统的发育，是从骨髓中的前单核细胞(6d)继续分化为成熟的单核细胞进入血液(1～3d)，经过血循环定居到组织，称巨噬细胞[4](数天～数周)。随着细胞的分化成熟，其粘附能力、吞噬能力、细胞因子产生及细胞表面分子(包括FC受体、CD分子、HLA分子)的表达等都逐渐增强。在体外组织培养中，圆形的单核细胞经3～7d培养后变成椭圆形、多角形或梭形的巨噬细胞，与免疫有关的表面分子渐丰，其合成和分泌细胞因子能力渐强。本文观察到体外培养时间越长，诱生IFN-α的能力越强，细胞培养2周所诱生的IFN-α水平明显高于1周的诱生水平。由此可见，只有成熟的巨噬细胞，才能诱生高水平的IFN-α，这与文献[2]报道一致。
, 百拇医药
M-CSF是由多种细胞产生的一类糖蛋白，能促进骨髓中干细胞增殖分化为单核吞噬细胞，并作用于循环的单核细胞和组织中的巨噬细胞，促进Mο-Mφ的增殖和分化，是M0-Mφ在体外长期生存的重要维持因子[5]。IFN-γ在Mο-Mφ生长和分化中起作用，目前公认IFN-γ是Mο-Mφ系统中最有力的活化因子[6]。本实验中，IFN-γ+NDV二者联合刺激与M-CSF+IFN-γ+NDV三者联合刺激所诱生的IFN-α水平接近，无显著差异(P>0.05)。提示：IFN-γ作为强而快的刺激剂发挥短程作用，M-CSF作为慢而弱的刺激剂发挥长程维持作用。
诱生α、β、γ3种干扰素的常用方法不同，通过病毒刺激外周血B细胞往往获得高效价IFN-α；polyI∶C刺激纤维母细胞获得高效价IFN-β；有丝分裂原如ConA、PHA等刺激外周血T细胞等则产生高价效IFN-γ。一般认为Mο-Mφ是几乎难于产生IFN-α的细胞，但文献[7]报道coxsackievirus B3(CVB3)体外感染人血单核细胞导致杀细胞感染，同时诱生中等水平的IFN-α，这是一个特殊的例外。病毒导致单核细胞的杂细胞感染的例子确实很少，HIV虽能感染人单核细胞，但并不诱生IFN-α。据本实验观察，无论有无M-CSF的预刺激，单独NDV刺激不能导致Mο-Mφ产生高水平的IFN-α，只有经过IFN-γ诱导细胞活化，NDV才能刺激产生较高水平的IFN-α，即二者联合作用效果极为明显。本文通过4种因素联合使用，MO-Mφ(在特定条件下)诱生IFN-α可达相当高的水平，这为研究MO-Mφ诱生IFN-α提供了参考。
, 百拇医药
作者简介 第一作者：女，36岁，硕士，讲师
参考文献
1 Warren MK，Palph R.CSF-1 stimulates monocytes factor production.J Immunol，1986，137：2281
2 Cantell K，Pirhonen J.IFN-γ enhances production of IFN-α in human macrophages but not in monocytes.J Interferon Cytokine Res，1996，16：461
3 黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术.北京：科学出版社，1990.266
4 Johnston RB.Monocytes and macrophages.New Engl J Med，1988，318(12)：747
, http://www.100md.com
5 Munn PH，Armstrong E.Regulation of monocyte differentiation in vitro.Cancer Res，1993，53：2603
6 Bohbot A，Eischen A，Feden C et al.U937 cell line：Impact of CSFs，IL-6 and IFN-γ on the differentiation and the Leu-CAM proteins expression.Exp Hematol，1993，21：564
7 Henke A，Mohr C，Sprenger H，et al.Coxsackievirus B3-induced production of tumor necrosis factor-α，IL-1β，and IL-6 in human monocytes.J Immunol，1992，148：2270
(1998-03-25收稿；1998-11-24修回), 百拇医药
单位：南京医科大学微生物学教研室 南京 210029
关键词：M-CSF；IFN-γ；IFN-α；NDV；单核细胞
免疫学杂志990212摘 要 观察了M-CSF预处理、IFN-γ预处理、长程培养及新城疫病毒(new-castle disease virus，NDV)刺激4个因素对正常人外周血单核细胞体外产生IFN-α水平的影响，采用生物活性法检测IFN-α。结果表明：单独使用M-CSF不能诱生IFN-α；单独使用IFN-γ或单独使用NDV均只诱生较低水平IFN-α，只有M-CSF+IFN-γ+NDV或IFN-γ+NDV联合使用方可诱生较高水平的IFN-α，并且发现Mο、-Mφ长程培养也是向高产发展的一个重要因素。结论：人血Mο、-Mφ在适当体外培养条件下，可以诱发较高水平的IFN-α。
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中图号 R392
ANALYSIS OF FACTORS AFFECTED IFN-α INDUCTION BY HUMAN BLOOD MONOCYTES IN VITRO
Sun Luhong，Yao Kun，Ji Xiaohui，Ding Runing，Li Huandi
(Department of Microbiology，Nanjing Medical University，Nanjing 210029)
Abstract Mο-Mφ could hardly induce IFN-α in vitro，especially at high level.This paper reported 4 factors affected IFN-α induction from cultured Mο-Mφ.The results showed treatment singly with M-CSF couldnt induce IFN-α.Treatment with IFN-γ alone or stimulation with NDV alone could induce low level of IFN-α.Treatment with M-CSF，IFN-γ and NDV proved to be the best.The age of Mο-Mφ culture was also an important factor.
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Key words M-CSF，IFN-γ，IFN-α，NDV，Monocyte
IFN-α的体外诱生通常用NDV或仙台病毒作用于B细胞，使之产生IFN-α，用Mο-Mφ(单核-巨噬细胞)诱生IFN-α是相当困难的。本文通过改变Mο-Mφ的培养条件，使之适于诱生IFN-α，观察了4种因素：M-CSF的预处理，IFN-γ的预处理，Mο-Mφ长程培养和NDV刺激对诱生IFN-α的影响。4种因素或单独使用或联合使用，出现许多不同的效应，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系和病毒：人羊膜WISH株按常规培养传代，用于滴定IFN-α；水泡性口炎病毒(VSV)本室低温保存，用于滴定IFN-α；NDV来自本室，用于诱生IFN-α。
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1.1.2 试剂：rhM-CSF由南京大学生物系提供，比活性1.2×106CFU/mg；rhIFN-γ由上海生物制品研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 单核细胞的分离[1]：从健康人新鲜静脉血中分离单个核细胞，以1×107/ml细胞浓度加入96孔细胞培养板，每孔200μl；置37°C 5%CO2贴壁培养2h；洗3次去非粘附细胞，贴壁的即为单核细胞，每孔约有贴壁细胞0.3×105～1×105个，经非特异性酯酶染色证实所得细胞95%以上为单核细胞。
1.2.2 IFN-α的诱生：根据参考文献[2]并予改进。诱生IFN-α共用4个可变因素，即NDV(血凝效价1∶1280)20μl/孔，M-CSF(5 000U/ml)100μl/孔，IFN-γ(1 000U/ml)100μl/孔和长程培养时间。培养条件均为37°C 5%CO2。①将含有单核细胞的培养板分别培养1，3，7，12d后，加IFN-γ、M-CSF或NDV分别培养24h，收集上清；或加IFN-γ、M-CSF分别培养24h后再加NDV培养24h，收集上清，详见表1。②在含有单核细胞的培养板孔内加入M-CSF分别预处理1，3，7，12d后，加入IFN-γ、NDV分别培养24h，收集上清；或加IFN-γ培养24h再加DNV培养24h，收集上清，详见表2。所收集培养上清，均经加热56°C 30min处理，以除去IFN-γ，移置-20°C保存，备测IFN-α。
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1.2.3 IFN-α的检测：通过细胞病变抑制试验[3]检测IFN-α活性，以能抑制CPE(++)的最高稀释度为终点。此读数为本室检测IFN-α的工作单位，而非国际标准单位。
2 结果
表1显示：单独M-CSF刺激不产生IFN-α；单独IFN-γ或单独NDV刺激，产生较低水平IFN-α；M-CSF+NDV联合刺激产生IFN-α水平也较低；只有IFN-γ+NDV联合刺激才能产生较高水平的IFN-α。此外，随着单核细胞培养时间延长，M-CSF组、IFN-γ组、NDV组和M-CSF+NDV组诱生IFN-α水平均无明显升高趋势，而IFN-γ+NDV组诱生IFN-α水平则逐渐升高，在1，3，7，12d产生IFN-α量与其它各组比均具显著性差异(P<0.01)
表1 培养不同时间后M-CSF/IFN-γ/NDV单独或联合刺激
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对单核细胞诱生IFN-α的影响(n＝5)
Tab 1 IFN-α production inducing with M-CSF/IFN-γ/NDV singly
or combinedly at different age of monocyte culture(n＝5) Different age of
monocyte culture
(days)
IFN-α activity (u/0.1ml)(
±s)Medium
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M-CSF
IFN-γ
NDV
M-CSF+NDV
(NDV after 1 day
treatment of M-CSF)
IFN-γ+DNV
(NDV after 1 day
treatment of IFN-γ)
1
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4.8±1.1
13.6±3.6
15.2±5.2
57.6±8.8
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6.0±2.5
14.4±6.1
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102.8±26.7
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7.6±0.9
16.0±5.8
16.8±4.4
115.2±28.6
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8.8±3.0
20.0±5.7
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192.0±64.0
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表2显示，单独用M-CSF预处理，对IFN-α几乎无诱生作用；经过M-CSF预处理再与IFN-γ或NDV联合刺激诱生作用较弱，并且不随M-CSF预处理时间延长而诱生作用增强；经M-CSF预处理再与IFN-γ和NDV联合刺激，诱生作用最强，且随着M-CSF预处理时间延长，M-CSF+IFN-γ+NDV三者联合刺激诱生IFN-α水平均逐渐升高，在1，3，7，12d诱生IFN-α水平的量与其它各组比较均具有显著性差异(P<0.01)。表2 M-CSF预处理不同时间后加刺激剂(IFN-γ/NDV)对单核细胞诱生IFN-α的影响(n＝5)
Tab 2 IFN-α produced by monocyte after pretreatment of M-CSF，then stimulated by IFN-γ/NDV(n＝5) Duration of M-CSF
pre-treatment
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IFN-α activity (u/0.1ml)(
±s)Medium
(with M-CSF)
IFN-γ
NDV
IFN-γ+NDV
(NDV after 1 day treatment of IFN-γ)
1
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6.4±2.0
16.0±5.6
76.8±17.5
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20.0±8.0
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25.6±8.7
204.0±28.6
3 讨论
Mο-Mφ系统的发育，是从骨髓中的前单核细胞(6d)继续分化为成熟的单核细胞进入血液(1～3d)，经过血循环定居到组织，称巨噬细胞[4](数天～数周)。随着细胞的分化成熟，其粘附能力、吞噬能力、细胞因子产生及细胞表面分子(包括FC受体、CD分子、HLA分子)的表达等都逐渐增强。在体外组织培养中，圆形的单核细胞经3～7d培养后变成椭圆形、多角形或梭形的巨噬细胞，与免疫有关的表面分子渐丰，其合成和分泌细胞因子能力渐强。本文观察到体外培养时间越长，诱生IFN-α的能力越强，细胞培养2周所诱生的IFN-α水平明显高于1周的诱生水平。由此可见，只有成熟的巨噬细胞，才能诱生高水平的IFN-α，这与文献[2]报道一致。
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M-CSF是由多种细胞产生的一类糖蛋白，能促进骨髓中干细胞增殖分化为单核吞噬细胞，并作用于循环的单核细胞和组织中的巨噬细胞，促进Mο-Mφ的增殖和分化，是M0-Mφ在体外长期生存的重要维持因子[5]。IFN-γ在Mο-Mφ生长和分化中起作用，目前公认IFN-γ是Mο-Mφ系统中最有力的活化因子[6]。本实验中，IFN-γ+NDV二者联合刺激与M-CSF+IFN-γ+NDV三者联合刺激所诱生的IFN-α水平接近，无显著差异(P>0.05)。提示：IFN-γ作为强而快的刺激剂发挥短程作用，M-CSF作为慢而弱的刺激剂发挥长程维持作用。
诱生α、β、γ3种干扰素的常用方法不同，通过病毒刺激外周血B细胞往往获得高效价IFN-α；polyI∶C刺激纤维母细胞获得高效价IFN-β；有丝分裂原如ConA、PHA等刺激外周血T细胞等则产生高价效IFN-γ。一般认为Mο-Mφ是几乎难于产生IFN-α的细胞，但文献[7]报道coxsackievirus B3(CVB3)体外感染人血单核细胞导致杀细胞感染，同时诱生中等水平的IFN-α，这是一个特殊的例外。病毒导致单核细胞的杂细胞感染的例子确实很少，HIV虽能感染人单核细胞，但并不诱生IFN-α。据本实验观察，无论有无M-CSF的预刺激，单独NDV刺激不能导致Mο-Mφ产生高水平的IFN-α，只有经过IFN-γ诱导细胞活化，NDV才能刺激产生较高水平的IFN-α，即二者联合作用效果极为明显。本文通过4种因素联合使用，MO-Mφ(在特定条件下)诱生IFN-α可达相当高的水平，这为研究MO-Mφ诱生IFN-α提供了参考。
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作者简介 第一作者：女，36岁，硕士，讲师
参考文献
1 Warren MK，Palph R.CSF-1 stimulates monocytes factor production.J Immunol，1986，137：2281
2 Cantell K，Pirhonen J.IFN-γ enhances production of IFN-α in human macrophages but not in monocytes.J Interferon Cytokine Res，1996，16：461
3 黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术.北京：科学出版社，1990.266
4 Johnston RB.Monocytes and macrophages.New Engl J Med，1988，318(12)：747
, http://www.100md.com
5 Munn PH，Armstrong E.Regulation of monocyte differentiation in vitro.Cancer Res，1993，53：2603
6 Bohbot A，Eischen A，Feden C et al.U937 cell line：Impact of CSFs，IL-6 and IFN-γ on the differentiation and the Leu-CAM proteins expression.Exp Hematol，1993，21：564
7 Henke A，Mohr C，Sprenger H，et al.Coxsackievirus B3-induced production of tumor necrosis factor-α，IL-1β，and IL-6 in human monocytes.J Immunol，1992，148：2270
(1998-03-25收稿；1998-11-24修回), 百拇医药