中药白鹤粉治疗肾小球肾炎的实验研究
http://www.100md.com
37c医学网
作者：杨宏 朱明德 黄佩文 张庆怡
单位：黄佩文(中国医学科学院 阜外医院，北京 100037)；张庆怡(上海第二医科大学 附属仁济医院)
关键词：阳离子化牛血清白蛋白；原位免疫复合物型肾炎；白鹤粉
成都中医药大学学报000223摘 要：目的：为中药白鹤粉治疗慢性肾小球肾炎提供实验证据。方法：采用Border的方法，用阳离子化牛血清白蛋白制作家兔原位免疫复合物肾炎模型，随机分成治疗组和对照组，治疗组给予中药白鹤粉治疗5周。结果：治疗组尿蛋白量明显减少(P<0.01)，血肌酐水平明显降低；免疫荧光检查发现对照组肾小球内IgG沉积明显，光镜和电镜下示肾组织病理改变明显，治疗组病变程度较轻。结论：中药白鹤粉治疗家兔原位免疫复合物肾小球肾炎模型有效，可能成为治疗人类肾小球肾炎的新药。
中图分类号：R285.5；R692.3 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)02-0042-02
, http://www.100md.com
Experimental Studies on Baihe Powderin Treatment of In
Situ Immune Complex Glomerulonephritis in Rabbits
Yang Hong, Zhu Mingde, Huang Peiwen, et al
Buwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science (Beijing 100037,China)
ABSTRACT:Objective： To provide experimental basis for Baihe powder in treatment of In Situ glomerulonephritis. Methods: Rabbit models made by intra-venous administration of cationic bovine serum albumin(C-BSA) were randomly divided into treatment and control groups, treatment group was treated for five weeks with Baihe powder. Results:Baihe powder can decrease the proteinuria and serum Cr and lessen the pathological damages of glomeri. Conclusions: Baihe powder proved to be an effective medicine in treatment of In Situ glomerulonephritis in rabbits.
, 百拇医药
KEY WORDS:Cationic bovine serum albumin; In Situ immune complex glomerulonephritis; experimental Studies
作者简介：杨宏，男，1967年4月生；医学博士；研究方向：心血管的临床药理研究。
慢性肾小球肾炎是临床上最常见的肾脏疾病之一，目前尚缺乏能控制病情发展的特效药[1]。近几年来祖国医学宝库的开发取得了可喜成果，其中雷公藤多甙对肾小球肾炎的治疗作用已被肯定并且在临床上推广使用[2，3]。白鹤粉是一种新开发的中药，系鸡屎白经处理后加工而成，国内尚未见用该药治疗肾小球肾炎的报道，我们用白鹤粉治疗家兔原位免疫复合物肾小球肾炎模型，观察其对该模型的治疗作用和可能的治疗机理，从而为该药的治疗作用提供一定的理论依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 实验对象
新西兰雄性大白兔25只，体重为l.8～2 Kg。
1.2 试剂和仪器
试剂：白鹤粉(浙江临海制药厂)，牛血清白蛋白、碳化二亚胺(中科院上海生化所)，大肠杆菌内毒素，羊抗兔IgG抗体(上海生物制品研究所)。
仪器：透视袋、比色计、超速离心机、真空冷冻干燥机(中科院上海生化所)，CTLL细胞株(上海第二医科大学)，3HtdR同位素(上海第二医科大学)。
1.3 原位免疫复合物肾小球肾炎模型的制作
(1)阳离子化牛血清白蛋白(BAS+)的合成：采用化学方法将牛血清白蛋白标记成阳离子化牛血清白蛋白，经电泳证实。
, 百拇医药
(2)实验动物的免疫：将大肠杆菌毒素和阳离子化牛血清白蛋白溶于0.15M，pH值为7.2的磷酸缓冲液(PBS)溶液中，最终浓度为每 mL溶液中含1 μg大肠杆菌毒素和1 mg牛血清白蛋白，每只兔经耳缘静脉注射2 mL，7天后开始免疫造型。
(3)家兔原位免疫复合物肾小球肾炎模型的制作：每只免疫兔每天经耳缘静脉给予阳离子化牛血清白蛋白20 mg(预先溶于0.15 M，pH值为7.2的PBS溶液中，浓度为20 mg/1.5mL)，共7周。
1.4 白鹤粉治疗实验性肾炎
家兔经致病免疫后第八天出现蛋白尿，2周后尿蛋白明显增加，蛋白定性++～++++，经病理证实原位免疫复合物肾小球肾炎模型已形成；根据随机分配的原则分别编入对照组和治疗组各10只，治疗组每日给予白鹤粉1.5g/kg*d，白鹤粉混于颗粒饲料中，对照组每日给予不含药物的颗粒饲料，整个疗程共5周，实验结束后处死所有动物。
, 百拇医药
1.5 主要观察指标
(l)尿蛋白：定性检查，免疫前2次，免疫后每2周1次；定量检查，免疫前1次，免疫后第6周1次。
(2)血生化：治疗前，治疗组和对照组各测定1次；治疗后，治疗组和对照组各测定1次。
(3)病理学检查：①免疫学检查：用羊抗兔IgG抗体标记荧光后检查肾小球内有无IgG沉积，上述荧光抗体为本研究室自行制备；②光镜：肾标本作HE、PASM、MASSON和银染色以观察；③病理形态改变：肾小球内皮细胞、系膜细胞和基质，毛细血管壁，毛细血管腔改变以及白细胞在肾小球的浸润情况；④电镜：观察肾小球内上皮细胞下电子致密沉积物多少以及足突融合程度。
(4)外周血IL-2测定：测定治疗组治疗前、后外周血IL-2水平。
1.6 统计学处理
, 百拇医药
各部分实验结果均以
±s表示；治疗组和对照组之间各指标的比较采用两样本均数t检验，P<0.05有统计学意义；治疗组治疗前后外周血IL-2水平比较采用配对t检验。
2 实验结果
2.1 24小时尿蛋白定量变化(见表1)
表1 用药前后尿蛋白定量变化(mg/24 h) 组 别
n
用药前1周尿蛋白量
用药后第6周尿蛋白量
治疗组
10
, 百拇医药
440.00±190.93
198.89±54.19**
对照组
10
429.17±167.90
431.11±160.42**
与对照组比较，**P<0.01。
用药前，治疗组和对照组无显著性差异(P>0.05)；白鹤粉治疗5周后，治疗组尿蛋白量明显减少，与对照组有显著性差异(P<0.01)。
2.2 血生化和肾功能(见表2)
, 百拇医药 表2 治疗组和对照组血生化改变 组 别
n
血浆白蛋白A(g/L)
肾 功 能
血清胆固醇
Chol(mmol/L)
BuN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
治疗组
10
21.14±8.90
8.30±2.17
, 百拇医药
61.39±13.50**
2.94±2.56
对照组
10
19.29±9.96
9.73±1.79
92.14±27.90
4.30±3.00
与对照组比较，**P<0.01。
实验结束后治疗组血Cr水平明显低于对照组而其它指标实验前后相比无显著性差异。
, 百拇医药 2.3 病理学检查
(1)免疫荧光：用药后5周，对照组可见肾小球内明显IGg沉积，荧光强度+～++，治疗组荧光强度+/-。
(2)光镜：用药后5周，对照组肾脏病改变明显：见肾小球内肿胀，内皮细胞和系膜细胞增生明显，足细胞肥大明显并有弥漫性白细胞浸润，偶见新月体形成，肾小球基底膜无明显改变，肾小球可见混浊肿胀；治疗组则见肾小球轻度肿胀，内皮细胞和系膜细胞轻度境生，局部白细胞浸润，肾小管无明显变化。
(3)电镜：对照组上皮细胞足突融合明显，上皮细胞下可见明显致密物沉积；治疗组则见病变程度较轻。
2.4 外周血IL-2水平测定(U/mL)(见表3)
表3 治疗组治疗前后外周血IL-2水平(U/mL) 模 型 号
, 百拇医药
1
3
4
6
9
11
17
23
治 疗 前
2
6
9
4
0*
, 百拇医药
10
4
3
治 疗 后
0
8
6
6
0
8
6
0
注：*凡浓度小于1U/mL按零计算。治疗前后比较，P>0.05。
, 百拇医药
3 讨 论
3.1 肾小球肾炎的确切病因和发病机理尚未明确，目前认为引起肾小球肾炎的免疫机制有3种：①抗肾小球基膜型，②循环免疫复合物型，③原位免疫复合物型。在研究肾炎的发病机理、观察药物疗效和研究治疗机理的过程中，建立一种代表性较好的动物模型是极其重要的。1982年Border等[3]应用静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)成功地制成原位免疫复合物肾小球肾炎模型，其发病机理系阳离子化牛血清自蛋白与肾小球基底膜所含的负电荷相结合，在肾小球原位形成免疫复合物然后导致肾炎的发生。北京医科大学章友康等用免疫荧光技术证明了C-BSA与肾小球基底膜直接结合形成原位复合物在诱发模型发病机理中的作用，并认为该模型接近人类膜性肾病，制作容易，发病率高，病理变化较一致，是肾炎研究较实用的模型之一。
3.2 本研究使用的药物白鹤粉是由鸡屎白经处理加工而成。《本经》记载：鸡屎白性味苦、咸、凉，入膀胱经，其功效有利水、泄热、解毒、祛风等。该药曾试用于治疗类风湿性关节炎、骨关节病等与免疫发病机理有关的疾病，鉴于肾小球肾炎的发病与免疫机理有关，因此我们应用白鹤粉治疗家兔原位免疫复合物型肾炎，并探讨其可能的治疗机理。实验中治疗组经白鹤粉治疗5周后，其24小时尿蛋白定量比对照组明显降低(P<0.01)；通过免疫荧光、光镜及电镜等免疫学和病理学的检查，发现对照组IgG荧光强度较治疗组明显增强，电镜显示对照组上皮细胞下致密沉积物较多，上皮细胞足突融合明显。故我们推测：①该药能抑制免疫复合物的沉积从而恢复和保护肾小球滤过的电荷屏障功能。正常肾小球滤过膜所含有的带负电荷的涎酸蛋白及带硫酸基团的蛋白多糖使整个肾小球滤过膜带负电荷，从而阻止了大部分血浆蛋白的滤过。该模型由于阳离子化牛血清白蛋白和正常肾小球滤过膜所含有的负电荷相结合[4，5]，从而破坏了这种屏障功能，然后由相应的抗原、抗体在原位形成免疫复合物，进而激活补体系统，补体系统又介导炎症反应，从而造成肾小球损伤，更进一步加重了滤过膜功能障碍而引起大量蛋白尿[6，7]；②对照组病理形态改变明显，肾小球肿胀，内皮细胞和系膜细胞增生明显，足细胞肥大呈弥漫性，肾小球内弥漫性白细胞浸润，偶可见新月体形成，提示该药可能具有抑制免疫复合物。补体介导和细胞免疫介导的炎症反应的作用，其机制可能与抑制某些炎症因子有关。该研究同时检测治疗组在治疗前后外周血IL-2水平，结果发现治疗前后外周血IL-2水平无明显改变，提示该药对外周血IL-2水平无明显影响，但缺乏关于其它细胞因子的实验资料。本实验提示该药治疗肾小球肾炎可能有效。
, 百拇医药
参考文献
l Soran In.An in vivo model for the experimental selection of drugs able to prevent immune complex glomerulonephritis Int[J].J.Immlinophazynac，1992，14：871
2 黄小平.药物治疗原位肾小球肾炎的实验研究[J].中华肾脏病杂志，1986，22：282
3 吴志英.雷公藤多试治疗家兔实验性肾炎[J].上海第二医科大学学报，1990，10(2)：6
4 Border WK.Induction of membranous nephropathy in rabbits by administration of an exogenous cationic antigen[J]. Clin Invest，1982;68：451
, http://www.100md.com
5 Couser WG.Mechanisms of glomerular injury in immune-complex diseases[J].Kidney Int，1985，28：569
6 Couser WG，et al.In Situ Immune complex formation and glornerular injury[J].Kidney Int，1980，17：1
7 Jean P，Paccarld.Complement and immune complex nephritis[J].Am J Nephrol，1989，9：2
8 Couser WG，et al.Complement and the direct mediation of immune glomerular injury，A new perspective[J]. Kidney Int，1985，28：879
(收稿日期：2000-02-14)
, 百拇医药
单位：黄佩文(中国医学科学院 阜外医院，北京 100037)；张庆怡(上海第二医科大学 附属仁济医院)
关键词：阳离子化牛血清白蛋白；原位免疫复合物型肾炎；白鹤粉
成都中医药大学学报000223摘 要：目的：为中药白鹤粉治疗慢性肾小球肾炎提供实验证据。方法：采用Border的方法，用阳离子化牛血清白蛋白制作家兔原位免疫复合物肾炎模型，随机分成治疗组和对照组，治疗组给予中药白鹤粉治疗5周。结果：治疗组尿蛋白量明显减少(P<0.01)，血肌酐水平明显降低；免疫荧光检查发现对照组肾小球内IgG沉积明显，光镜和电镜下示肾组织病理改变明显，治疗组病变程度较轻。结论：中药白鹤粉治疗家兔原位免疫复合物肾小球肾炎模型有效，可能成为治疗人类肾小球肾炎的新药。
中图分类号：R285.5；R692.3 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)02-0042-02
, http://www.100md.com
Experimental Studies on Baihe Powderin Treatment of In
Situ Immune Complex Glomerulonephritis in Rabbits
Yang Hong, Zhu Mingde, Huang Peiwen, et al
Buwai Hospital, Chinese Academy of Medical Science (Beijing 100037,China)
ABSTRACT:Objective： To provide experimental basis for Baihe powder in treatment of In Situ glomerulonephritis. Methods: Rabbit models made by intra-venous administration of cationic bovine serum albumin(C-BSA) were randomly divided into treatment and control groups, treatment group was treated for five weeks with Baihe powder. Results:Baihe powder can decrease the proteinuria and serum Cr and lessen the pathological damages of glomeri. Conclusions: Baihe powder proved to be an effective medicine in treatment of In Situ glomerulonephritis in rabbits.
, 百拇医药
KEY WORDS:Cationic bovine serum albumin; In Situ immune complex glomerulonephritis; experimental Studies
作者简介：杨宏，男，1967年4月生；医学博士；研究方向：心血管的临床药理研究。
慢性肾小球肾炎是临床上最常见的肾脏疾病之一，目前尚缺乏能控制病情发展的特效药[1]。近几年来祖国医学宝库的开发取得了可喜成果，其中雷公藤多甙对肾小球肾炎的治疗作用已被肯定并且在临床上推广使用[2，3]。白鹤粉是一种新开发的中药，系鸡屎白经处理后加工而成，国内尚未见用该药治疗肾小球肾炎的报道，我们用白鹤粉治疗家兔原位免疫复合物肾小球肾炎模型，观察其对该模型的治疗作用和可能的治疗机理，从而为该药的治疗作用提供一定的理论依据。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 实验对象
新西兰雄性大白兔25只，体重为l.8～2 Kg。
1.2 试剂和仪器
试剂：白鹤粉(浙江临海制药厂)，牛血清白蛋白、碳化二亚胺(中科院上海生化所)，大肠杆菌内毒素，羊抗兔IgG抗体(上海生物制品研究所)。
仪器：透视袋、比色计、超速离心机、真空冷冻干燥机(中科院上海生化所)，CTLL细胞株(上海第二医科大学)，3HtdR同位素(上海第二医科大学)。
1.3 原位免疫复合物肾小球肾炎模型的制作
(1)阳离子化牛血清白蛋白(BAS+)的合成：采用化学方法将牛血清白蛋白标记成阳离子化牛血清白蛋白，经电泳证实。
, 百拇医药
(2)实验动物的免疫：将大肠杆菌毒素和阳离子化牛血清白蛋白溶于0.15M，pH值为7.2的磷酸缓冲液(PBS)溶液中，最终浓度为每 mL溶液中含1 μg大肠杆菌毒素和1 mg牛血清白蛋白，每只兔经耳缘静脉注射2 mL，7天后开始免疫造型。
(3)家兔原位免疫复合物肾小球肾炎模型的制作：每只免疫兔每天经耳缘静脉给予阳离子化牛血清白蛋白20 mg(预先溶于0.15 M，pH值为7.2的PBS溶液中，浓度为20 mg/1.5mL)，共7周。
1.4 白鹤粉治疗实验性肾炎
家兔经致病免疫后第八天出现蛋白尿，2周后尿蛋白明显增加，蛋白定性++～++++，经病理证实原位免疫复合物肾小球肾炎模型已形成；根据随机分配的原则分别编入对照组和治疗组各10只，治疗组每日给予白鹤粉1.5g/kg*d，白鹤粉混于颗粒饲料中，对照组每日给予不含药物的颗粒饲料，整个疗程共5周，实验结束后处死所有动物。
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1.5 主要观察指标
(l)尿蛋白：定性检查，免疫前2次，免疫后每2周1次；定量检查，免疫前1次，免疫后第6周1次。
(2)血生化：治疗前，治疗组和对照组各测定1次；治疗后，治疗组和对照组各测定1次。
(3)病理学检查：①免疫学检查：用羊抗兔IgG抗体标记荧光后检查肾小球内有无IgG沉积，上述荧光抗体为本研究室自行制备；②光镜：肾标本作HE、PASM、MASSON和银染色以观察；③病理形态改变：肾小球内皮细胞、系膜细胞和基质，毛细血管壁，毛细血管腔改变以及白细胞在肾小球的浸润情况；④电镜：观察肾小球内上皮细胞下电子致密沉积物多少以及足突融合程度。
(4)外周血IL-2测定：测定治疗组治疗前、后外周血IL-2水平。
1.6 统计学处理
, 百拇医药
各部分实验结果均以
±s表示；治疗组和对照组之间各指标的比较采用两样本均数t检验，P<0.05有统计学意义；治疗组治疗前后外周血IL-2水平比较采用配对t检验。2 实验结果
2.1 24小时尿蛋白定量变化(见表1)
表1 用药前后尿蛋白定量变化(mg/24 h) 组 别
n
用药前1周尿蛋白量
用药后第6周尿蛋白量
治疗组
10
, 百拇医药
440.00±190.93
198.89±54.19**
对照组
10
429.17±167.90
431.11±160.42**
与对照组比较，**P<0.01。
用药前，治疗组和对照组无显著性差异(P>0.05)；白鹤粉治疗5周后，治疗组尿蛋白量明显减少，与对照组有显著性差异(P<0.01)。
2.2 血生化和肾功能(见表2)
, 百拇医药 表2 治疗组和对照组血生化改变 组 别
n
血浆白蛋白A(g/L)
肾 功 能
血清胆固醇
Chol(mmol/L)
BuN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
治疗组
10
21.14±8.90
8.30±2.17
, 百拇医药
61.39±13.50**
2.94±2.56
对照组
10
19.29±9.96
9.73±1.79
92.14±27.90
4.30±3.00
与对照组比较，**P<0.01。
实验结束后治疗组血Cr水平明显低于对照组而其它指标实验前后相比无显著性差异。
, 百拇医药 2.3 病理学检查
(1)免疫荧光：用药后5周，对照组可见肾小球内明显IGg沉积，荧光强度+～++，治疗组荧光强度+/-。
(2)光镜：用药后5周，对照组肾脏病改变明显：见肾小球内肿胀，内皮细胞和系膜细胞增生明显，足细胞肥大明显并有弥漫性白细胞浸润，偶见新月体形成，肾小球基底膜无明显改变，肾小球可见混浊肿胀；治疗组则见肾小球轻度肿胀，内皮细胞和系膜细胞轻度境生，局部白细胞浸润，肾小管无明显变化。
(3)电镜：对照组上皮细胞足突融合明显，上皮细胞下可见明显致密物沉积；治疗组则见病变程度较轻。
2.4 外周血IL-2水平测定(U/mL)(见表3)
表3 治疗组治疗前后外周血IL-2水平(U/mL) 模 型 号
, 百拇医药
1
3
4
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9
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17
23
治 疗 前
2
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治 疗 后
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注：*凡浓度小于1U/mL按零计算。治疗前后比较，P>0.05。
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3 讨 论
3.1 肾小球肾炎的确切病因和发病机理尚未明确，目前认为引起肾小球肾炎的免疫机制有3种：①抗肾小球基膜型，②循环免疫复合物型，③原位免疫复合物型。在研究肾炎的发病机理、观察药物疗效和研究治疗机理的过程中，建立一种代表性较好的动物模型是极其重要的。1982年Border等[3]应用静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)成功地制成原位免疫复合物肾小球肾炎模型，其发病机理系阳离子化牛血清自蛋白与肾小球基底膜所含的负电荷相结合，在肾小球原位形成免疫复合物然后导致肾炎的发生。北京医科大学章友康等用免疫荧光技术证明了C-BSA与肾小球基底膜直接结合形成原位复合物在诱发模型发病机理中的作用，并认为该模型接近人类膜性肾病，制作容易，发病率高，病理变化较一致，是肾炎研究较实用的模型之一。
3.2 本研究使用的药物白鹤粉是由鸡屎白经处理加工而成。《本经》记载：鸡屎白性味苦、咸、凉，入膀胱经，其功效有利水、泄热、解毒、祛风等。该药曾试用于治疗类风湿性关节炎、骨关节病等与免疫发病机理有关的疾病，鉴于肾小球肾炎的发病与免疫机理有关，因此我们应用白鹤粉治疗家兔原位免疫复合物型肾炎，并探讨其可能的治疗机理。实验中治疗组经白鹤粉治疗5周后，其24小时尿蛋白定量比对照组明显降低(P<0.01)；通过免疫荧光、光镜及电镜等免疫学和病理学的检查，发现对照组IgG荧光强度较治疗组明显增强，电镜显示对照组上皮细胞下致密沉积物较多，上皮细胞足突融合明显。故我们推测：①该药能抑制免疫复合物的沉积从而恢复和保护肾小球滤过的电荷屏障功能。正常肾小球滤过膜所含有的带负电荷的涎酸蛋白及带硫酸基团的蛋白多糖使整个肾小球滤过膜带负电荷，从而阻止了大部分血浆蛋白的滤过。该模型由于阳离子化牛血清白蛋白和正常肾小球滤过膜所含有的负电荷相结合[4，5]，从而破坏了这种屏障功能，然后由相应的抗原、抗体在原位形成免疫复合物，进而激活补体系统，补体系统又介导炎症反应，从而造成肾小球损伤，更进一步加重了滤过膜功能障碍而引起大量蛋白尿[6，7]；②对照组病理形态改变明显，肾小球肿胀，内皮细胞和系膜细胞增生明显，足细胞肥大呈弥漫性，肾小球内弥漫性白细胞浸润，偶可见新月体形成，提示该药可能具有抑制免疫复合物。补体介导和细胞免疫介导的炎症反应的作用，其机制可能与抑制某些炎症因子有关。该研究同时检测治疗组在治疗前后外周血IL-2水平，结果发现治疗前后外周血IL-2水平无明显改变，提示该药对外周血IL-2水平无明显影响，但缺乏关于其它细胞因子的实验资料。本实验提示该药治疗肾小球肾炎可能有效。
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参考文献
l Soran In.An in vivo model for the experimental selection of drugs able to prevent immune complex glomerulonephritis Int[J].J.Immlinophazynac，1992，14：871
2 黄小平.药物治疗原位肾小球肾炎的实验研究[J].中华肾脏病杂志，1986，22：282
3 吴志英.雷公藤多试治疗家兔实验性肾炎[J].上海第二医科大学学报，1990，10(2)：6
4 Border WK.Induction of membranous nephropathy in rabbits by administration of an exogenous cationic antigen[J]. Clin Invest，1982;68：451
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5 Couser WG.Mechanisms of glomerular injury in immune-complex diseases[J].Kidney Int，1985，28：569
6 Couser WG，et al.In Situ Immune complex formation and glornerular injury[J].Kidney Int，1980，17：1
7 Jean P，Paccarld.Complement and immune complex nephritis[J].Am J Nephrol，1989，9：2
8 Couser WG，et al.Complement and the direct mediation of immune glomerular injury，A new perspective[J]. Kidney Int，1985，28：879
(收稿日期：2000-02-14)
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