用睾丸细胞共培养探讨吡哆醇对大鼠睾丸细胞的毒性
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37c医学网
作者：黄厚今 王瑞淑 徐维光 杨青
单位：563003 遵义医学院(黄厚今)；华西医科大学营养与食品卫生学教研室(王瑞淑、徐维光)，劳动卫生学教研室(杨青)
关键词：吡哆醇；睾丸；大鼠；Sertoli-germ细胞共培养
用睾丸细胞共培养探讨吡哆醇 对大鼠睾丸细胞的毒性 【摘要】 目的 探讨吡哆醇(PN)对大鼠睾丸的体外毒性。 方法 采用在Williams方法的基础上改进的Sertoli-germ细胞共培养系统，观察PN在不同剂量和接触时间对培养细胞的作用。 结果 脱落生精细胞数随PN浓度的增高和接触时间的延长而增加，并有明显的剂量—效应和时间—效应关系。同时，还观察到Sertoli细胞骨架出现松弛、回缩等效应。 结论 PN对大鼠生精细胞的体外效应反映了其对Sertoli细胞的损害。睾丸细胞共培养方法对探讨PN对大鼠睾丸的毒性作用具有实用价值。
, 百拇医药
Effects of pyridoxine on rat testis cells in Sertoli-germ cell co-culture system
Huang Houjin,Wang Ruishu,Xu Weiguang,et al.Zunyi Medical College,Zunyi 563003
【Abstract】 Objective To understand the toxic effects of pyridoxine(PN) on rat testis cells in vitro. Method In a Sertoli-germ cells co-culture system modified from Williams method,the toxic effects of PN at different concentrations and exposed duration were observed. Results The detachment of germ cells showed marked dose-response and time-response relationships.Meanwhile,the characteristic of loosing and retracting skeleton in the Sertoli cells was found. Conclusion The effects produced by PN in vitro may reflect damage to Sertoli cells,and testicular cells co-culture could be of value for the study of underlying mechanisms of toxic effects of PN on rat testis.
, 百拇医药
【Key words】 Pyridoxine Testis Rat Sertoli-germ cell co-culture
Vit B6是一种水溶性维生素，毒性很低。随着近年来研究的深入，其作为药品、辅助药品和保健品的应用范围不断扩大，使患者及某些特殊职业人群甚至一般居民都可能摄入过量的Vit B6。据报道，过量摄入Vit B6可引起人和动物的神经系统损害和动物的睾丸毒性[1]。睾丸是雄性生殖系统中最主要的器官，也是很多生殖毒物的靶器官。由于睾丸结构和功能的复杂性，以及睾丸与丘脑、垂体之间的相互作用，使体内研究方法难于鉴别毒物作用的靶及其作用机制。在大量离体评价睾丸功能和毒性效应的模型中，Sertoli-germ细胞共培养是应用广泛的离体测试系统[2]，经测试，许多睾丸毒物在该系统中引起生精细胞脱落与在活体内引起的相应效应有较好的一致性。本实验根据优化的培养条件探讨吡哆醇(PN)对Sertoli-germ细胞共培养系统的作用及其特点。
, 百拇医药
材料与方法
1.实验动物：选用3周龄未断乳雄性SD幼鼠，体重40～50g。由国家医药管理局四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供。
2.主要设备和试剂：YJ-1450型医用净化工作台(苏州净化设备公司)、CO2孵箱(Heraeus)、24孔培养板(NUNC)、倒置显微镜(Olympus)。最低必需培养基(MEM，GibcoBRL)、HEPES(MERCK)、小牛血清(FBS，华西医科大学分子生物研究室)、胰蛋白酶(1∶250，DIFCO)、胶原酶(Sigma)、盐酸吡哆醇(C8H11O3PN*HCl=205.64，含量为99%，上海化学试剂采购供应站)、考马斯亮蓝G250(Coomassie BB，进口分装，上海化学试剂采购供应站)、Triton X-100(上海化学试剂采购供应站分装厂)。
3.细胞分离培养方法：在Williams[3]方法的基础上加以改进。无菌取出大鼠睾丸，用Hanks液清洗。解剖显微镜下弃除白膜和可见血管，剪碎至约1 mm长。加入0.25%胰蛋白酶，33℃消化15分钟。用含20%小牛血清的MEM中止消化后过滤，再经0.1%胶原酶在33℃下消化15分钟，过滤，离心。将细胞团悬浮于按要求配制的MEM中，苔盼蓝试验显示蓝染细胞少于3%。将细胞调整到1.6×106/ml后加入培养板，每孔1 ml，置32.5～33.0℃5%CO2和95%潮湿空气的孵箱中进行培养。24小时后吸去培养液，加入无FBS(含不同浓度PN)的MEM，在不同时点观察细胞生长状态和进行脱落细胞计数。
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4.细胞鉴别：分别参考Coomassie BB法[4]、Feulgen法[5]、碱性磷酸酶(ALP)法、偶氮偶联法和HE染色鉴定细胞种类。
5.时效和量效的观察：在预试验的基础上，用不含FBS的MEM将PN分别配制成0.1、1.0、10.0、20.0mg/ml浓度。细胞经24小时贴壁后，吸去培养基，加入含不同浓度PN的MEM，每组安排8个复孔，于不同时点观察细胞生长情况，收集各孔培养液进行细胞计数，以8孔的平均脱落细胞数计。每日换液1次，24小时以上组的脱落细胞为累计细胞数。
6.光镜下细胞骨架的初步观察：将Sertoli-germ细胞培养片进行Coomassie BB染色，观察在不同浓度PN作用下Sertoli细胞骨架特点。
7.统计方法：用PEMS和SPSS-PC系统进行方差分析和相关分析。
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结 果
1.分离培养效果的观察和细胞学鉴定：苔盼蓝排斥试验显示，蓝染细胞<3%，表明酶消化适度。培养24小时后，倒置显微镜下见细胞贴壁均匀，Sertoli细胞已长成以长形为主的多角形状，生精细胞贴于其上，培养基中浮动细胞很少，表明细胞生长良好。
HE、Feulgen、Coomassie和ALP染色显示：HE染色条件下，胞浆色淡，边缘不清，其内有吞噬样物和空泡，有生精细胞附于其上，细胞核为圆或椭圆形，色淡而均，核仁1～2个；Feulgen染色见核内卫星核小体，Coomassie染色则显示细胞呈长条或多角形，核及细胞浆染色均较淡，核内颗粒分布均匀，未见核仁。胞浆内细胞骨架纵向分布为主，均可舒展，其间可见吞噬物样碎片和大小不一的空泡。同样染色的成纤维细胞则可见多个粗大核仁，胞浆内无空泡；ALP染色属阴性而呈淡黄色。200倍镜下每个视野可见1～2个红染细胞(即管周细胞)。
2.时效和量效关系：脱落生精细胞数随浓度和时间而增加(表1)。5个时间点的r值分别为0.7901、0.9626、0.9797、0.9771、0.9694；P值分别为0.1117、0.0086、0.0035，呈显著相关。
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表1 盐酸吡哆醇(PN.HCl)引起生精细胞脱落的时间及剂量效应(n=8,
±s)
Table 1 Time- and dose-response of PN.HCl on germ-cell
detachment from adhesion to Sertoli cell in co-culture(n=8,±s)
PN*HCl
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(mg/ml)
不同时间的脱落细胞数(×104/ml)
Counts of detached germ cells
(×104/ml) at different times
6 h
12 h
24 h
48 h
72 h
0
6.375±1.9226
, 百拇医药
8.125±3.7201
16.250±4.3997
18.500±5.6315
30.625±6.8855
0.1
6.625±2.1998
9.125±3.9001
17.500±3.5857
25.750±4.5277
38.625±6.0930
1.0
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7.000±2.2678
10.625±2.2683
20.000±5.5032
38.375±5.5790**
51.500±8.6685**
10.0
7.125±3.2923
12.500±3.5456
26.250±6.7135**
59.250±11.9014**
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72.250±18.6605**
20.0
7.250±2.2520
15.375±6.3682**
45.500±9.3903**
88.250±15.8633**
98.875±16.4442**
方差分析：与对照组比较，**P<0.01 **P<0.01 vs. control by ANOA
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3.Sertoli细胞骨架的变化：对照组Sertoli细胞自然伸展，均匀淡染，细胞骨架以纵向为主自然伸展。而随PN剂量增大和接触时间延长，其胞浆逐渐松弛、回缩，乃至断裂、消失，细胞染色稍加深，生精细胞脱落。
讨 论
1.Sertoli-germ共培养方法的确立：本实验采用胰蛋白酶和胶原酶分离Sertoli细胞和生精细胞，苔盼蓝染色显示活细胞占97%以上，在本实验条件下细胞生长良好。
经多种染色显示：培养物基本为生精细胞和支持细胞，管周细胞在1%以内，未见成纤维细胞。说明培养物以Sertoli细胞和生精细胞为主体，其一般生长状态与Gray等[6]的研究结果相似。
在睾丸细胞体外培养中，很难保证培养物是纯目标细胞，因而鉴别培养物的细胞种类与含量是体外培养的一个重要内容。在多种鉴别方法中，综合特异性和实用性，目前一般多以3-羟类固醇脱氢酶、ALP、Feulgen或甲绿—哌郎宁作为常用的细胞鉴别染色方法。本实验采用其中两种方法，效果良好。
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2.PN对Sertoli-germ细胞共培养的效应及其可能机制：实验结果显示，在Sertoli-germ细胞共培养中加入PN，可引起生精细胞的脱落，并随剂量的增加和接触时间的延长而增加。在0.1 mg/ml组，虽然生精细胞脱落数的绝对值高于对照组，但差异无显著性，因而估计PN对此共培养系统中细胞脱落效应的最大无作用浓度在0.1mg/ml左右。
活真核细胞中，骨架系统与细胞运动、形态维持、细胞内物质转运、细胞产物的分泌、细胞分裂时的染色体运动等有关。对Sertoli细胞骨架的研究揭示：Sertoli细胞为高度不对称性细胞，其内微管丰富呈纵向分布，微管破坏时细胞趋于变圆或接近对称形状。Sertoli细胞的微丝也很丰富，这些结构与生精细胞周期中的形状变化有重要关系。由于Sertoli细胞对各级生精细胞有广泛接触并提供营养、激素和形状的支持，其骨架的破坏势必导致生精细胞的脱落。Russell等[7]观察微管破坏剂秋水仙碱和长春新碱对大鼠精曲小管结构影响时，显示两种药物均引起Sertoli细胞结构破坏和生精细胞脱落。
, 百拇医药
尽管在本系统中不能除外PN通过非Sertoli细胞介导的直接或间接途径引起生精细胞脱落的可能，但在Sertoli-germ细胞离体系统中所见到的Sertoli细胞骨架改变与生精细胞脱落的程度是一致的，这一结果也与Mori等[1]报道活体给予PN引起大鼠生精细胞脱落和Sertoli细胞变性萎缩的现象相一致。提示PN可能通过破坏Sertoli细胞骨架而引起生精细胞脱落。
参 考 文 献
[1] Mori K,Kaido M,Fujishire K,et al.Effects of megadoses of pyridoxine on spermatogenesis and male reproductive organs in rats.Arch Toxicol,1992,66:198-203.
[2] Gray TJB.Testicular toxicity in vitro:Sertoli-germ cell co-culture as a model.Food Chem Toxicol,1986,24:601-605.
, 百拇医药
[3] Williams J,Foster PMD.The production of lactate and pyruvate as sensitive indices of altered rat Sertoli cell function in vitro following the addition of various testiclar toxicants.Toxicol Appl Pharmacol,1988,94:160-170.
[4] 鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995.153-155.
[5] 江泉观，于永强主编.雄性生殖毒理学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1994.75-76.
[6] Gray TJB,Beamend JA.Effect of some phthalate esters and other testicular toxins on primary cultures of testicular cells.Food Chem Toxicol,1984,22:123-131.
[7] Russell LD,Wong V.Three-dimensional reconstruction of a Stage V rat Sertoli cell:size,configuration,and general relationship to germ cells.J Androl,1981,2:24-25.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-06-06), 百拇医药
单位：563003 遵义医学院(黄厚今)；华西医科大学营养与食品卫生学教研室(王瑞淑、徐维光)，劳动卫生学教研室(杨青)
关键词：吡哆醇；睾丸；大鼠；Sertoli-germ细胞共培养
用睾丸细胞共培养探讨吡哆醇 对大鼠睾丸细胞的毒性 【摘要】 目的 探讨吡哆醇(PN)对大鼠睾丸的体外毒性。 方法 采用在Williams方法的基础上改进的Sertoli-germ细胞共培养系统，观察PN在不同剂量和接触时间对培养细胞的作用。 结果 脱落生精细胞数随PN浓度的增高和接触时间的延长而增加，并有明显的剂量—效应和时间—效应关系。同时，还观察到Sertoli细胞骨架出现松弛、回缩等效应。 结论 PN对大鼠生精细胞的体外效应反映了其对Sertoli细胞的损害。睾丸细胞共培养方法对探讨PN对大鼠睾丸的毒性作用具有实用价值。
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Effects of pyridoxine on rat testis cells in Sertoli-germ cell co-culture system
Huang Houjin,Wang Ruishu,Xu Weiguang,et al.Zunyi Medical College,Zunyi 563003
【Abstract】 Objective To understand the toxic effects of pyridoxine(PN) on rat testis cells in vitro. Method In a Sertoli-germ cells co-culture system modified from Williams method,the toxic effects of PN at different concentrations and exposed duration were observed. Results The detachment of germ cells showed marked dose-response and time-response relationships.Meanwhile,the characteristic of loosing and retracting skeleton in the Sertoli cells was found. Conclusion The effects produced by PN in vitro may reflect damage to Sertoli cells,and testicular cells co-culture could be of value for the study of underlying mechanisms of toxic effects of PN on rat testis.
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【Key words】 Pyridoxine Testis Rat Sertoli-germ cell co-culture
Vit B6是一种水溶性维生素，毒性很低。随着近年来研究的深入，其作为药品、辅助药品和保健品的应用范围不断扩大，使患者及某些特殊职业人群甚至一般居民都可能摄入过量的Vit B6。据报道，过量摄入Vit B6可引起人和动物的神经系统损害和动物的睾丸毒性[1]。睾丸是雄性生殖系统中最主要的器官，也是很多生殖毒物的靶器官。由于睾丸结构和功能的复杂性，以及睾丸与丘脑、垂体之间的相互作用，使体内研究方法难于鉴别毒物作用的靶及其作用机制。在大量离体评价睾丸功能和毒性效应的模型中，Sertoli-germ细胞共培养是应用广泛的离体测试系统[2]，经测试，许多睾丸毒物在该系统中引起生精细胞脱落与在活体内引起的相应效应有较好的一致性。本实验根据优化的培养条件探讨吡哆醇(PN)对Sertoli-germ细胞共培养系统的作用及其特点。
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材料与方法
1.实验动物：选用3周龄未断乳雄性SD幼鼠，体重40～50g。由国家医药管理局四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供。
2.主要设备和试剂：YJ-1450型医用净化工作台(苏州净化设备公司)、CO2孵箱(Heraeus)、24孔培养板(NUNC)、倒置显微镜(Olympus)。最低必需培养基(MEM，GibcoBRL)、HEPES(MERCK)、小牛血清(FBS，华西医科大学分子生物研究室)、胰蛋白酶(1∶250，DIFCO)、胶原酶(Sigma)、盐酸吡哆醇(C8H11O3PN*HCl=205.64，含量为99%，上海化学试剂采购供应站)、考马斯亮蓝G250(Coomassie BB，进口分装，上海化学试剂采购供应站)、Triton X-100(上海化学试剂采购供应站分装厂)。
3.细胞分离培养方法：在Williams[3]方法的基础上加以改进。无菌取出大鼠睾丸，用Hanks液清洗。解剖显微镜下弃除白膜和可见血管，剪碎至约1 mm长。加入0.25%胰蛋白酶，33℃消化15分钟。用含20%小牛血清的MEM中止消化后过滤，再经0.1%胶原酶在33℃下消化15分钟，过滤，离心。将细胞团悬浮于按要求配制的MEM中，苔盼蓝试验显示蓝染细胞少于3%。将细胞调整到1.6×106/ml后加入培养板，每孔1 ml，置32.5～33.0℃5%CO2和95%潮湿空气的孵箱中进行培养。24小时后吸去培养液，加入无FBS(含不同浓度PN)的MEM，在不同时点观察细胞生长状态和进行脱落细胞计数。
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4.细胞鉴别：分别参考Coomassie BB法[4]、Feulgen法[5]、碱性磷酸酶(ALP)法、偶氮偶联法和HE染色鉴定细胞种类。
5.时效和量效的观察：在预试验的基础上，用不含FBS的MEM将PN分别配制成0.1、1.0、10.0、20.0mg/ml浓度。细胞经24小时贴壁后，吸去培养基，加入含不同浓度PN的MEM，每组安排8个复孔，于不同时点观察细胞生长情况，收集各孔培养液进行细胞计数，以8孔的平均脱落细胞数计。每日换液1次，24小时以上组的脱落细胞为累计细胞数。
6.光镜下细胞骨架的初步观察：将Sertoli-germ细胞培养片进行Coomassie BB染色，观察在不同浓度PN作用下Sertoli细胞骨架特点。
7.统计方法：用PEMS和SPSS-PC系统进行方差分析和相关分析。
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结 果
1.分离培养效果的观察和细胞学鉴定：苔盼蓝排斥试验显示，蓝染细胞<3%，表明酶消化适度。培养24小时后，倒置显微镜下见细胞贴壁均匀，Sertoli细胞已长成以长形为主的多角形状，生精细胞贴于其上，培养基中浮动细胞很少，表明细胞生长良好。
HE、Feulgen、Coomassie和ALP染色显示：HE染色条件下，胞浆色淡，边缘不清，其内有吞噬样物和空泡，有生精细胞附于其上，细胞核为圆或椭圆形，色淡而均，核仁1～2个；Feulgen染色见核内卫星核小体，Coomassie染色则显示细胞呈长条或多角形，核及细胞浆染色均较淡，核内颗粒分布均匀，未见核仁。胞浆内细胞骨架纵向分布为主，均可舒展，其间可见吞噬物样碎片和大小不一的空泡。同样染色的成纤维细胞则可见多个粗大核仁，胞浆内无空泡；ALP染色属阴性而呈淡黄色。200倍镜下每个视野可见1～2个红染细胞(即管周细胞)。
2.时效和量效关系：脱落生精细胞数随浓度和时间而增加(表1)。5个时间点的r值分别为0.7901、0.9626、0.9797、0.9771、0.9694；P值分别为0.1117、0.0086、0.0035，呈显著相关。
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表1 盐酸吡哆醇(PN.HCl)引起生精细胞脱落的时间及剂量效应(n=8,
±s)Table 1 Time- and dose-response of PN.HCl on germ-cell
detachment from adhesion to Sertoli cell in co-culture(n=8,
±s)PN*HCl
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(mg/ml)
不同时间的脱落细胞数(×104/ml)
Counts of detached germ cells
(×104/ml) at different times
6 h
12 h
24 h
48 h
72 h
0
6.375±1.9226
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8.125±3.7201
16.250±4.3997
18.500±5.6315
30.625±6.8855
0.1
6.625±2.1998
9.125±3.9001
17.500±3.5857
25.750±4.5277
38.625±6.0930
1.0
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7.000±2.2678
10.625±2.2683
20.000±5.5032
38.375±5.5790**
51.500±8.6685**
10.0
7.125±3.2923
12.500±3.5456
26.250±6.7135**
59.250±11.9014**
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72.250±18.6605**
20.0
7.250±2.2520
15.375±6.3682**
45.500±9.3903**
88.250±15.8633**
98.875±16.4442**
方差分析：与对照组比较，**P<0.01 **P<0.01 vs. control by ANOA
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3.Sertoli细胞骨架的变化：对照组Sertoli细胞自然伸展，均匀淡染，细胞骨架以纵向为主自然伸展。而随PN剂量增大和接触时间延长，其胞浆逐渐松弛、回缩，乃至断裂、消失，细胞染色稍加深，生精细胞脱落。
讨 论
1.Sertoli-germ共培养方法的确立：本实验采用胰蛋白酶和胶原酶分离Sertoli细胞和生精细胞，苔盼蓝染色显示活细胞占97%以上，在本实验条件下细胞生长良好。
经多种染色显示：培养物基本为生精细胞和支持细胞，管周细胞在1%以内，未见成纤维细胞。说明培养物以Sertoli细胞和生精细胞为主体，其一般生长状态与Gray等[6]的研究结果相似。
在睾丸细胞体外培养中，很难保证培养物是纯目标细胞，因而鉴别培养物的细胞种类与含量是体外培养的一个重要内容。在多种鉴别方法中，综合特异性和实用性，目前一般多以3-羟类固醇脱氢酶、ALP、Feulgen或甲绿—哌郎宁作为常用的细胞鉴别染色方法。本实验采用其中两种方法，效果良好。
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2.PN对Sertoli-germ细胞共培养的效应及其可能机制：实验结果显示，在Sertoli-germ细胞共培养中加入PN，可引起生精细胞的脱落，并随剂量的增加和接触时间的延长而增加。在0.1 mg/ml组，虽然生精细胞脱落数的绝对值高于对照组，但差异无显著性，因而估计PN对此共培养系统中细胞脱落效应的最大无作用浓度在0.1mg/ml左右。
活真核细胞中，骨架系统与细胞运动、形态维持、细胞内物质转运、细胞产物的分泌、细胞分裂时的染色体运动等有关。对Sertoli细胞骨架的研究揭示：Sertoli细胞为高度不对称性细胞，其内微管丰富呈纵向分布，微管破坏时细胞趋于变圆或接近对称形状。Sertoli细胞的微丝也很丰富，这些结构与生精细胞周期中的形状变化有重要关系。由于Sertoli细胞对各级生精细胞有广泛接触并提供营养、激素和形状的支持，其骨架的破坏势必导致生精细胞的脱落。Russell等[7]观察微管破坏剂秋水仙碱和长春新碱对大鼠精曲小管结构影响时，显示两种药物均引起Sertoli细胞结构破坏和生精细胞脱落。
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尽管在本系统中不能除外PN通过非Sertoli细胞介导的直接或间接途径引起生精细胞脱落的可能，但在Sertoli-germ细胞离体系统中所见到的Sertoli细胞骨架改变与生精细胞脱落的程度是一致的，这一结果也与Mori等[1]报道活体给予PN引起大鼠生精细胞脱落和Sertoli细胞变性萎缩的现象相一致。提示PN可能通过破坏Sertoli细胞骨架而引起生精细胞脱落。
参 考 文 献
[1] Mori K,Kaido M,Fujishire K,et al.Effects of megadoses of pyridoxine on spermatogenesis and male reproductive organs in rats.Arch Toxicol,1992,66:198-203.
[2] Gray TJB.Testicular toxicity in vitro:Sertoli-germ cell co-culture as a model.Food Chem Toxicol,1986,24:601-605.
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[3] Williams J,Foster PMD.The production of lactate and pyruvate as sensitive indices of altered rat Sertoli cell function in vitro following the addition of various testiclar toxicants.Toxicol Appl Pharmacol,1988,94:160-170.
[4] 鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995.153-155.
[5] 江泉观，于永强主编.雄性生殖毒理学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1994.75-76.
[6] Gray TJB,Beamend JA.Effect of some phthalate esters and other testicular toxins on primary cultures of testicular cells.Food Chem Toxicol,1984,22:123-131.
[7] Russell LD,Wong V.Three-dimensional reconstruction of a Stage V rat Sertoli cell:size,configuration,and general relationship to germ cells.J Androl,1981,2:24-25.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-06-06), 百拇医药