NO介导细胞因子失衡致儿童慢性淋巴细胞性甲状腺炎发病的作用
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作者：董文斌 冉隆瑞 肖大成
单位：董文斌(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)；冉隆瑞(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)；肖大成(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)
关键词：甲状腺炎；自身免疫；一氧化氮；γ干扰素；白细胞介素4
细胞与分子免疫学杂志000116
摘要：目的探讨一氧化氮(nitricoxide,NO)介导的细胞因子失衡，在儿童慢性淋巴细胞性甲状腺炎(CLT)发病中的作用。方法对初诊(CLT)患儿13例外周血单个核细胞(PBMC)产生的NO水平及其与IFNγ和IL4水平失衡和甲状腺功能受损的关系进行了研究。结果与正常组相比，患儿NO和IFNγ水平明显升高(P<0.001)，IL4的水平明显降低(P<0.002)；NO水平与IFNγ和血清TSH水平呈显著的正相关(P<0.05)，而与IL4及血清T3，T4的水平呈显著的负相关(P<0.05)。结论NO作为细胞因子水平失衡的介质，参与了CLT的发病。
, 百拇医药
中图号：R593.2 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0049-50
Role of cytokine imbalance mediated by nitric oxide in pathogenesis of chronic lymphocytic thyroiditis in children
DONG Wen-bin,RAN Long-rui,XIAO Da-cheng
Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
, 百拇医药
Abstract: Aim To probe the role of serum nitric oxide(NO)in invasion of chronic lymphocytic thyroiditis(CLT) as a mediator of cytokine imbalance. Methods NO concentration and IFN-γ /IL-4 levels produced by PBMC, and their relationships to thyroidal function were investigated in 13 children with CLT. Results NO concentration and IFN-γ level were significantly increased(P< 0.01), while IL-4 level was markedly decreased(P< 0.01) compared with the control group. There were strong positive correlations between NO concentration and the levels of IFN-γ and TSH(P< 0.05). There were strong negative correlations between the NO concentration and the levels of IL-4, T3 and T4(P< 0.05). Conclusion NO could be involved in the development of chronic lymphocytic thyroiditis as a mediator of cytokines imbalance.
, 百拇医药
Keywords: thyoiditis; autoimmunity; nitric oxide; IFN-γ ; IL-4
慢性淋巴细胞性甲状腺炎(chronic lymphocytic thyoiditis, CLT)是一种自身免疫性疾病。在碘供应充足的地区，它是小儿弥漫性甲状腺肿和获得性甲状腺功能减退最常见的原因。本病发病过程中存在Th1细胞因子异常亢进〔1〕，但是细胞因子如何参与发病尚不清楚。NO是由机体内多种细胞产生的一种多功能介质，作为内皮源性舒张因子及神经递质参与免疫防御，也参与炎症和自身免疫介导的组织损伤〔2〕。但其在CLT的发病过程中，是否可介导Th1/Th2类细胞因子失衡而导致甲状腺功能损伤，国内外罕见报道。为此，我们选用目前认为最能代表体内Th1/Th2类细胞因子的指标(分别为IFN-γ和IL-4)〔3〕，研究了CLT患儿PBMC产生的NO及上述这两种因子的水平，并探讨了它们与CLT发病的关系。
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1 材料和方法
1.1 对象 疾病组：确诊CLT的患儿13例，均为女性，年龄3～13岁，平均9.5±2.7岁，其临床表现和实验室检查均符合CLT的诊断标准〔4〕。正常对照组：均为健康儿童，经询问病史和查体及必要的实验室检查，排除了心、肝、肾及免疫性疾病，年龄和性别与疾病组无显著性差异(P<0.05)。
1.2 方法 常规分离PBMC， 用含100 mL/L FCS的RPMI 1640液重悬细胞，并将细胞密度配成1×109/L。加入PHA(广州医药工业研究所产品，终质量浓度为100 mg/L)和LPS(北京邦定公司提供，终质量浓度为 2 mg/L)作为刺激剂，在50 mL/L CO2，37℃条件下培养72 h，收集上清液，-30℃保存，集中检测。外周血血清的分离，按本室常规进行。上清液中INF-γ水平的检测采用ABCELISA法。药盒系第二军医大学微生物学教研室产品。上清液中IL-4水平的检测采用双抗体夹心ELISA法，药盒由深圳晶美生物工程公司提供，按产品说明书进行。NO的检测采用亚硝酸盐比色法，试剂盒购置于北京邦定公司。甲状腺功能及自身抗体的检测采用RIA法，药盒由上海放射免疫技术所提供。
, 百拇医药
统计学处理:结果用均数±标准差 (
±s)表示，用两样本均数比较的t检验测试差异显著性；部分指标间的关系，用直线相关分析进行处理。检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 血清NO，IFN-γ及IL-4 CLT患儿与正常儿童血清NO浓度，IFN-γ和IL-4的水平，检测结果见表1。
表1 CLT患儿血清NO浓度和细胞因子水平
Tab 1 Changes in NO and cytokines levels in CLT children (±s)
Children
, 百拇医药
n
NO(μmol/L)
IFN-γ(ng/L)
IL-4(ng/L)
CLT
13
416±199b
2225±634b
223±63b
Normal
10
243±122
, 百拇医药
1426±646
378±109
bP<0.01 vs normal.
2.2 细胞因子水平失衡与NO的关系 经相关分析发现，CLT患儿PBMC产生的NO水平与IFN-γ水平呈显著的正相关(r=0.71，P<0.05)，而与IL-4水平呈显著的负相关(r=-0.56，P<0.05)。
2.3 NO与甲状腺功能损害的关系 经相关分析发现，CLT患儿PBMC产生的NO水平与血清T3和T4的水平呈显著的负相关(r分别为-0.79和-0.64，P<0.05)，而与血清TSH的水平呈显著的正相关(r=0.56，P<0.05)。
3 讨 论
CLT属于一种器官特异性自身免疫病，其发病与机体免疫功能的紊乱有关。细胞因子作为免疫反应中的一类高活性的蛋白质介质，可能是认识本病发病机制的重要线索。本文结果显示，CLT患儿PBMC产生的NO和IFN-γ水平明显升高，IL-4水平明显降低，且NO水平与IFN-γ水平呈显著的正相关，而与IL-4的水平呈显著的负相关，说明PBMC产生的NO与细胞因子的失衡密切相关。进一步分析显示，NO的水平与血清T3和T4水平的降低呈显著的负相关，而与TSH水平的升高呈显著的正相关。由此推测，NO在体内的产生很有可能是通过导致甲状腺功能损伤，而参与CLT的发病过程。
, 百拇医药
我们以往的研究与国外多数学者〔1，3〕的研究均证实，CLT是一种由Th1细胞介导的自身免疫性疾病。CLT患儿体内细胞因子的类型以IFN-γ，IL-2和IL-12等Th1类细胞因子的增高和IL-4，IL-10等Th2类细胞因子的明显减弱为特征。有研究显示，细胞因子是NO的潜在诱导剂，Th1类细胞因子(如IFN-γ)可激活单核巨噬细胞产生NO〔2〕，而Th2类细胞因子(如IL-4等)则抑制其产生〔5〕。因此，CLT患儿体内Th1类细胞因子的增高及Th2类细胞因子的下降，将导致NO水平升高，这可能是NO水平与细胞因子失衡呈显著相关的原因所在。
高水平的NO可作为细胞因子失衡的介质导致周围组织损伤〔6，7〕。近年研究发现，NO在自身免疫性疾病的发病过程中起重要的作用〔2〕。有研究显示，在实验性变态反应性脑脊髓膜炎的发病过程中，中枢神经系统存在大量的淋巴细胞浸润，这些细胞可通过产生NO等炎症介质来损伤星形细胞〔8〕。在糖尿病的发病中，NO有可能通过直接毒性作用，激活细胞内的酶及诱导其它炎症介质的产生等机制，而导致胰岛细胞DNA的破坏〔9，10〕。在培养的甲状腺体系中，观察到NO可通过抑制细胞对碘的聚集和参与甲状腺激素合成酶的活性来抑制激素的合成〔11〕。这些可能是CLT患儿NO水平升高与甲状腺功能损伤密切相关的原因，而细胞因子的失衡又可诱导一些炎症介质(如NO)的产生，通过上述机制而导致甲状腺功能的损伤。因此，调控NO的合成可能是治疗CLT的一种新的措施。
, 百拇医药
作者简介：董文斌，男,31岁，讲师，医学硕士
泸州市太平街25号，Tel.(0830)2292789- 5324
董文斌(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)
冉隆瑞(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)
肖大成(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)
参考文献：
〔1〕 Zipris D. Evidence that Th1 lymphocytes predominate in islet inflammation and thyoiditis in the BioBreeding(BB)rat〔J〕 . J Autoimmune, 1996;9:315- 319.
, 百拇医药
〔2〕 Vladutiu AO. Role of nitric oxide in autoimmunity〔J〕 . Clin Immunol Immunopathol, 1995;(1) :1- 11.
〔3〕 Rocken M, Racke M, Shevach EM, et al. IL-4-induced immune deviation as antigen-specific therapy for inflammatory autoimmune disease〔J〕 . Immunol Today, 1996; 17:225.
〔4〕倪桂臣，颜纯.甲状腺疾病.见:颜纯，李永昶主编.小儿内分泌学〔M〕.北京：人民卫生出版社，1990：111-120.
〔5〕 Taylor-Robinson A, Phillips RS, Severn A, et al. The role of Th1 and Th2 cells in a rodent malaria infection〔J〕 . Science, 1993; 260:1931- 1934.
, http://www.100md.com
〔6〕 Kolb H, Kol-Bachofen V. Nitric oxide: a pathogenetic factor in autoimmunity〔J〕 . Immunol Today, 1992; 13:157- 160.
〔7〕 Van Dervort AL, Yan L, Madara PJ, et al. Nitric oxide regulates endotoxin-induced TNF-α production by human neutrophils〔J〕 . J Immunol, 1994;152:4102- 4109.
〔8〕 Lin RF, Lin TS, Tilton RG, et al. Nitric oxide localized to spinal cords of mice with experimental autoimmune encephalitis: an electron paramagnetic resonance study〔J〕 . J Exp Med, 1993; 178:643- 648.
, http://www.100md.com
〔9〕 Kallman B, Burkart V, Kroncke KD, et al. Toxicity of chemically generated nitric oxide towards pancreatic islet can be prevented by nicotinamide〔J〕 . Life Sci, 1992;52:671- 678.
〔10〕 Burkart V, Kroncke DK, Kolb-Bachofen V, et al. Nitric oxide as an inflammatory mediator in insulin-dependent diabetes-mellitus- a new therapeutic target〔J〕 . Clin Immunother, 1994;2:233- 239.
〔11〕 Kasai K, Hattori Y, Nakanishi N, et al. Regulation of inducible nitric oxide production by cytokines in human thyrocytes in culture〔J〕 . Endocrinology, 1995;136:4261- 4270.
收稿日期：1999-01-18
修回日期：1999-04-06, 百拇医药
单位：董文斌(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)；冉隆瑞(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)；肖大成(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)
关键词：甲状腺炎；自身免疫；一氧化氮；γ干扰素；白细胞介素4
细胞与分子免疫学杂志000116
摘要：目的探讨一氧化氮(nitricoxide,NO)介导的细胞因子失衡，在儿童慢性淋巴细胞性甲状腺炎(CLT)发病中的作用。方法对初诊(CLT)患儿13例外周血单个核细胞(PBMC)产生的NO水平及其与IFNγ和IL4水平失衡和甲状腺功能受损的关系进行了研究。结果与正常组相比，患儿NO和IFNγ水平明显升高(P<0.001)，IL4的水平明显降低(P<0.002)；NO水平与IFNγ和血清TSH水平呈显著的正相关(P<0.05)，而与IL4及血清T3，T4的水平呈显著的负相关(P<0.05)。结论NO作为细胞因子水平失衡的介质，参与了CLT的发病。
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中图号：R593.2 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0049-50
Role of cytokine imbalance mediated by nitric oxide in pathogenesis of chronic lymphocytic thyroiditis in children
DONG Wen-bin,RAN Long-rui,XIAO Da-cheng
Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
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Abstract: Aim To probe the role of serum nitric oxide(NO)in invasion of chronic lymphocytic thyroiditis(CLT) as a mediator of cytokine imbalance. Methods NO concentration and IFN-γ /IL-4 levels produced by PBMC, and their relationships to thyroidal function were investigated in 13 children with CLT. Results NO concentration and IFN-γ level were significantly increased(P< 0.01), while IL-4 level was markedly decreased(P< 0.01) compared with the control group. There were strong positive correlations between NO concentration and the levels of IFN-γ and TSH(P< 0.05). There were strong negative correlations between the NO concentration and the levels of IL-4, T3 and T4(P< 0.05). Conclusion NO could be involved in the development of chronic lymphocytic thyroiditis as a mediator of cytokines imbalance.
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Keywords: thyoiditis; autoimmunity; nitric oxide; IFN-γ ; IL-4
慢性淋巴细胞性甲状腺炎(chronic lymphocytic thyoiditis, CLT)是一种自身免疫性疾病。在碘供应充足的地区，它是小儿弥漫性甲状腺肿和获得性甲状腺功能减退最常见的原因。本病发病过程中存在Th1细胞因子异常亢进〔1〕，但是细胞因子如何参与发病尚不清楚。NO是由机体内多种细胞产生的一种多功能介质，作为内皮源性舒张因子及神经递质参与免疫防御，也参与炎症和自身免疫介导的组织损伤〔2〕。但其在CLT的发病过程中，是否可介导Th1/Th2类细胞因子失衡而导致甲状腺功能损伤，国内外罕见报道。为此，我们选用目前认为最能代表体内Th1/Th2类细胞因子的指标(分别为IFN-γ和IL-4)〔3〕，研究了CLT患儿PBMC产生的NO及上述这两种因子的水平，并探讨了它们与CLT发病的关系。
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1 材料和方法
1.1 对象 疾病组：确诊CLT的患儿13例，均为女性，年龄3～13岁，平均9.5±2.7岁，其临床表现和实验室检查均符合CLT的诊断标准〔4〕。正常对照组：均为健康儿童，经询问病史和查体及必要的实验室检查，排除了心、肝、肾及免疫性疾病，年龄和性别与疾病组无显著性差异(P<0.05)。
1.2 方法 常规分离PBMC， 用含100 mL/L FCS的RPMI 1640液重悬细胞，并将细胞密度配成1×109/L。加入PHA(广州医药工业研究所产品，终质量浓度为100 mg/L)和LPS(北京邦定公司提供，终质量浓度为 2 mg/L)作为刺激剂，在50 mL/L CO2，37℃条件下培养72 h，收集上清液，-30℃保存，集中检测。外周血血清的分离，按本室常规进行。上清液中INF-γ水平的检测采用ABCELISA法。药盒系第二军医大学微生物学教研室产品。上清液中IL-4水平的检测采用双抗体夹心ELISA法，药盒由深圳晶美生物工程公司提供，按产品说明书进行。NO的检测采用亚硝酸盐比色法，试剂盒购置于北京邦定公司。甲状腺功能及自身抗体的检测采用RIA法，药盒由上海放射免疫技术所提供。
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统计学处理:结果用均数±标准差 (
±s)表示，用两样本均数比较的t检验测试差异显著性；部分指标间的关系，用直线相关分析进行处理。检验水准α=0.05。2 结 果
2.1 血清NO，IFN-γ及IL-4 CLT患儿与正常儿童血清NO浓度，IFN-γ和IL-4的水平，检测结果见表1。
表1 CLT患儿血清NO浓度和细胞因子水平
Tab 1 Changes in NO and cytokines levels in CLT children (
±s)Children
, 百拇医药
n
NO(μmol/L)
IFN-γ(ng/L)
IL-4(ng/L)
CLT
13
416±199b
2225±634b
223±63b
Normal
10
243±122
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1426±646
378±109
bP<0.01 vs normal.
2.2 细胞因子水平失衡与NO的关系 经相关分析发现，CLT患儿PBMC产生的NO水平与IFN-γ水平呈显著的正相关(r=0.71，P<0.05)，而与IL-4水平呈显著的负相关(r=-0.56，P<0.05)。
2.3 NO与甲状腺功能损害的关系 经相关分析发现，CLT患儿PBMC产生的NO水平与血清T3和T4的水平呈显著的负相关(r分别为-0.79和-0.64，P<0.05)，而与血清TSH的水平呈显著的正相关(r=0.56，P<0.05)。
3 讨 论
CLT属于一种器官特异性自身免疫病，其发病与机体免疫功能的紊乱有关。细胞因子作为免疫反应中的一类高活性的蛋白质介质，可能是认识本病发病机制的重要线索。本文结果显示，CLT患儿PBMC产生的NO和IFN-γ水平明显升高，IL-4水平明显降低，且NO水平与IFN-γ水平呈显著的正相关，而与IL-4的水平呈显著的负相关，说明PBMC产生的NO与细胞因子的失衡密切相关。进一步分析显示，NO的水平与血清T3和T4水平的降低呈显著的负相关，而与TSH水平的升高呈显著的正相关。由此推测，NO在体内的产生很有可能是通过导致甲状腺功能损伤，而参与CLT的发病过程。
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我们以往的研究与国外多数学者〔1，3〕的研究均证实，CLT是一种由Th1细胞介导的自身免疫性疾病。CLT患儿体内细胞因子的类型以IFN-γ，IL-2和IL-12等Th1类细胞因子的增高和IL-4，IL-10等Th2类细胞因子的明显减弱为特征。有研究显示，细胞因子是NO的潜在诱导剂，Th1类细胞因子(如IFN-γ)可激活单核巨噬细胞产生NO〔2〕，而Th2类细胞因子(如IL-4等)则抑制其产生〔5〕。因此，CLT患儿体内Th1类细胞因子的增高及Th2类细胞因子的下降，将导致NO水平升高，这可能是NO水平与细胞因子失衡呈显著相关的原因所在。
高水平的NO可作为细胞因子失衡的介质导致周围组织损伤〔6，7〕。近年研究发现，NO在自身免疫性疾病的发病过程中起重要的作用〔2〕。有研究显示，在实验性变态反应性脑脊髓膜炎的发病过程中，中枢神经系统存在大量的淋巴细胞浸润，这些细胞可通过产生NO等炎症介质来损伤星形细胞〔8〕。在糖尿病的发病中，NO有可能通过直接毒性作用，激活细胞内的酶及诱导其它炎症介质的产生等机制，而导致胰岛细胞DNA的破坏〔9，10〕。在培养的甲状腺体系中，观察到NO可通过抑制细胞对碘的聚集和参与甲状腺激素合成酶的活性来抑制激素的合成〔11〕。这些可能是CLT患儿NO水平升高与甲状腺功能损伤密切相关的原因，而细胞因子的失衡又可诱导一些炎症介质(如NO)的产生，通过上述机制而导致甲状腺功能的损伤。因此，调控NO的合成可能是治疗CLT的一种新的措施。
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作者简介：董文斌，男,31岁，讲师，医学硕士
泸州市太平街25号，Tel.(0830)2292789- 5324
董文斌(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)
冉隆瑞(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)
肖大成(泸州医学院附属医院儿科，四川泸州646000)
参考文献：
〔1〕 Zipris D. Evidence that Th1 lymphocytes predominate in islet inflammation and thyoiditis in the BioBreeding(BB)rat〔J〕 . J Autoimmune, 1996;9:315- 319.
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〔5〕 Taylor-Robinson A, Phillips RS, Severn A, et al. The role of Th1 and Th2 cells in a rodent malaria infection〔J〕 . Science, 1993; 260:1931- 1934.
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〔6〕 Kolb H, Kol-Bachofen V. Nitric oxide: a pathogenetic factor in autoimmunity〔J〕 . Immunol Today, 1992; 13:157- 160.
〔7〕 Van Dervort AL, Yan L, Madara PJ, et al. Nitric oxide regulates endotoxin-induced TNF-α production by human neutrophils〔J〕 . J Immunol, 1994;152:4102- 4109.
〔8〕 Lin RF, Lin TS, Tilton RG, et al. Nitric oxide localized to spinal cords of mice with experimental autoimmune encephalitis: an electron paramagnetic resonance study〔J〕 . J Exp Med, 1993; 178:643- 648.
, http://www.100md.com
〔9〕 Kallman B, Burkart V, Kroncke KD, et al. Toxicity of chemically generated nitric oxide towards pancreatic islet can be prevented by nicotinamide〔J〕 . Life Sci, 1992;52:671- 678.
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〔11〕 Kasai K, Hattori Y, Nakanishi N, et al. Regulation of inducible nitric oxide production by cytokines in human thyrocytes in culture〔J〕 . Endocrinology, 1995;136:4261- 4270.
收稿日期：1999-01-18
修回日期：1999-04-06, 百拇医药