左旋精氨酸对离体兔肺脏保存质量的影响
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作者：王齐敏 廖崇先 陈道中
单位：福建医科大学附属协和医院心胸外科 350001
关键词：左旋精氨酸；肺脏保存；动物实验
心肺血管病杂志000222
摘要 观察左旋精氨酸对离体兔肺脏保存的保护作用，健康家兔随机分成对照组(EC组)和实验组(Arg组)，每组15只，EC组兔肺脏予Euro-collins液进行灌洗，Arg组予含左旋精氨酸的EC液进行灌洗肺脏，灌洗总量60 ml/kg，灌注压力20 cm水柱，灌毕完整取下心肺组织浸入保存液4℃环境冷藏，7 h后取肺进行离体复灌，测定肺血管阻力，血气分析，肺血管对Ach舒血管反应性，肺组织湿干重比例及肺组织电镜检查等指标。EC组肺血管阻力，肺组织湿干重比例均高于Arg组，肺血管对Ach反应性EC组较Arg组差，血气指标EC组下降明显，Arg组肺组织形态轻微改变，而EC组水肿明显渗出严重。左旋精氨酸具有改善离体兔肺脏的保存效果。
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The Effect of L-Arginine on Rabbit Lung Preservation
Wang Qimin,Liao Chongxian,Chen Daozhong
(Department of cardiac surgery,Union Hospial Fujian Medical
University,Fuzhou,Fujian 350001)
Abstract The effect of L-Arginine Arg on lung preseration Method: 30 rabbits were divided into Euro-collins(EC)and Arg groups.Lung were flushed with EC solution in EC group,and Args group with Arg solution which contained 0.2 mg/ml L-Arginine.After being flushed the heart-lung blocks were harvested and stored in 4 ℃ cold solution for 7 hours.The lungs were reperfused with flesh venous blood.Pulmonary vascular resistance (PVR),blood gas analysis,achinduced vosodilation.lung tissue wet/dry ratio and histologic changes were observed.Result:the W/D and PVR were higher in EC group than those in Arg group.Ach-induced vosodilation and the vesults of blood gas analysis were better in Arg group than those in EC group.Histologic changes were minimal in Arg group.Conclusion:L-Arginine improved the quality of rabbit lungs preservation,which might be the result of its endothelial protection.
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Key words:L-Arginine; Lung preservation
近年来，随着基础研究的深入，血管内皮细胞的功能日益受到重视，许多证据表明内皮功能损害，一氧化氮(NO)合成减少与组织缺血再灌注损伤关系密切[1]，也发现低温保存后的肺脏血管，内皮功能受损[2]，因此，如何保护肺血管内皮细胞减轻缺血再灌注损伤，成为离体器官保存研究的新课题。外源性左旋精氨酸能够促进内皮细胞的NO合成，对组织缺血再灌注损伤具有保护作用[3～4]，作者在Euro-collins(EC)液中加入左旋精氨酸，观察其对离体兔肺的影响。
材料和方法
1.研究对象及分组 健康家兔30只(由福建医科大学实验动物中心提供)，体重1.7～2.4 kg，按照随机原则，分为对照组(EC组)和实验组(Arg组)，每组15只。EC组应用EC液，Arg组在EC液中加入左旋精氨酸0.2 mg/ml。
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2.实验步骤 兔芬太尼10～20 ug/kg经耳缘静脉注射后，全麻，气管切开，接呼吸机(DH-10型，浙江医科大学)，调节呼吸频率40次/min，潮气量15 ml/kg，予空气通气。兔去毛消毒，前正中线开胸，剪除纵隔胸膜切除胸腺暴露气管，打开心包，游离上下腔静脉，按200单位/kg经右心耳进行肝素化，经右室流出道插入16GA肺动脉灌注管并固定。
结扎上下腔静脉，阻断升主动脉，经肺动脉灌4℃保存液，同时剪开左右心耳，保存液灌注压力控制20 cm水柱，灌注总量60 ml/kg，灌注毕，让肺保持中度膨胀状态，切断气管，取出完整心肺组织，浸入4℃的保存液中继续冷藏，保存7 h，再行离体复灌。
复灌时参照LS Wang模型[5]，取出心肺组织，固定好肺动脉灌注管，灌注管经三通开关一端接压力表，一端连蠕动泵。气管接呼吸机呼吸参数如同前述。复灌采用稀释新鲜静脉血，血球压积25%左右，复灌流量20 ml/min，复灌时间15 min。
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3.指标观察 肺血管阻力(PVR)：于复灌后每隔3 min记录1次，PVR=肺动脉平均压力/流量，单位mm Hg/ml/min。血气分析：取稀释静脉血及复灌后3 min、12 min的肺静脉血1.5 ml进行血气测定，记录血氧分压PvO2单位 mm Hg。肺血管对乙酰胆碱(Ach)舒张的反应性：记录复灌12 min时肺动脉平均压力，然后经肺动脉注入Achl 0～8 mol/kg，观察肺动脉压力变化，取得低数值，根据肺动脉平均压降低的百分数作结果。肺组织湿/干重比例(W/D Ratio)：复灌毕取左肺称重后置80℃干燥箱中烘干，再称重，两者比值为结果。
电镜检查 复灌毕各组随机抽取3例，从右上肺表面取一小块肺组织进行初固定，再切成1 mm 3薄片后固定、脱水、包埋、切片、染色观察。
4.统计学处理 数据结果X±S表示，组间比较用t检验，以P<0.05为统计学上差别有显著意义。
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结 果
1.一般资料 2组间兔的体重，稀释后待灌静脉血的血球压积血氧分压，血pH值，无统计学上的差异。
图1 复灌后肺阻力
图2 复灌后肺静脉血氧分压
2.肺组织湿/干重比例测定结果 EC组为10.5±0.48，Arg组为9.96±0.40 (P<0.05)。
3.肺血管对Ach舒张血管的反应性测定结果 (1)EC组肺动脉推注Ach后，肺动脉平均压降低8.7±0.7%；(2)Arg组肺动脉推注Ach，肺动脉平均压降低15±2.3%。
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4.超微结构改变 EC组：肺泡出血、渗出，可见中性粒细胞浸润；Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞肿胀，线粒体肿胀，内质网扩张，板层体脱落，毛细血管内皮细胞肿胀，细胞间隙增宽，排列疏散，肺泡间质水肿(图3)。Arg组：肺泡未见明显出血、渗出，未见粒细胞浸润；肺泡上皮Ⅰ、Ⅱ型细胞无肿胀粒体结构大致正常，内质网清晰，板层体正常，内皮细胞未见肿胀，可见吞饮现象，细胞间隙正常，基底膜完整，肺间质轻度肿胀(图4)。
图3 EC组 ×12000肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞肿胀，板层体脱落线粒体肿胀，内质网扩张
图4 Arg组 ×8000肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞无肿胀，间质无水肿毛细血管内皮细胞吞饮丰富，基膜完整
讨 论
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在过去30年，人们围绕着供肺保存开展了大量实验研究工作，但至今仍未获得满意的结果，尽管有作者报道，保存12 h甚至18 h后肺功能完好，但临床应用的安全时限仍仅4 h左右，超过此限，将严重影响术后早期的肺功能从而产生更多的并发症及更高的死亡率。因此，提高供肺保存质量，从而延长供肺保存时间，仍是该领域迫切需要解决的课题，Guaghan系统研究了EC液[6]，发现EC液低温保存4 h，肺质量完好，6 h已经受损，8 h则明显损害，根据其研究结果，本课题选择7 h，作为保存时限，以便与实验组进行对照。
本实验显示 L-Arg能够减轻肺组织水肿，与EC组比较，Arg组W/D比值较低；L-Arg能够扩张肺血管降低肺阻力，复灌3 min后，Arg组的PVR均明显低于EC组(P<0.05或P<0.01)；L-Arg能够改善通气/血流比例，实验中可以看出，在复灌后2个时间点，Arg组血氧分压均高于EC组；形态学结果显示：EC组肺泡出血，见大量粒细胞聚集，肺间质水肿，毛细血管充血，内皮细胞肿胀而Arg组肺组织基本正常。上述结果说明，L-Arg能明显改善肺保存的质量。
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L-Arg主要通过促进内皮细胞增加NO合成而发挥药理作用[7]。L-Arg在一氧化氮合成酶(NOS)催化下，产生NO，NO可直接弥散至血管平滑肌细胞，与之结合，激活鸟苷酸环化酶，增加细胞内cGMP浓度，促进Na+-Ca2+转换，使平滑肌松驰，扩张血管。而缺血缺氧肺血管收缩，已被证实L-Arg能够降低缺氧性肺动脉高压，其次L-Arg可以增加内皮细胞抗中性粒细胞(PMN)粘附作用，避免其粘附活化释放有害物质，从而保护肺组织细胞，实验中观察到Arg组肺毛细血管、肺间质及肺胞腔内无明显PMN聚集现象，再者NO能够直接进入血小板，增加cGMP，导致血小板活性降低，聚集力下降，另一方面NO也可抑制PMN释放血小板活化因子使血小板活性减低，从而避免血栓形成。许多实验表明静滴L-Arg可使血浆中的内皮素浓度下降[8]，ET是体内已知缩血管作用最强的物质，肺血管平滑肌和支气管平滑肌细胞均有大量ET受体，缺血缺氧，ET合成增加，使肺血管强烈收缩和支气管痉挛，L-Arg通过增加NO合成抑制ET生成，从而扩张肺动脉，舒张支气管，改善通气/血流比值，提高氧合能力。
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参考文献
1，David L,Wessel MD，Ian Adatia MB，et al. Use of inhaled nitric oxide and acetylcholine in the evaluation of pulmonary hypertension and endothelial function after CPB.Crculation,1993,88：2128～2138.
2，Kimblad Per Ola MD，Stig steen MD.Pulmonary vascular resistance related to endothelial function after lung transplantation.Ann Thorac Surg,1994,58:416～420.
3，Lihua Xiong MD,Michel Masmanian MD,Chapelier MD,et al.Lung preservation with euro-collins,University of wisconsin,wallwork,and low-potassi-um-dextran solutions.Ann Thorac Surg,1994,58:845～850.
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4，Anderew S,Weyrich PhD,Xiu-Liang Ma MD.PhD;and Allan M.lefer;PhD The Role of L-Arginine in ameliorating reperfusion injury after myocardial ischemia in the cat.Circulation,1992,86:279～288.
5，Liang-shun Wang MD,Koechi yoshikawa MD,Shinichiro Miyoshi MD,et al.The effect of ischemic time and temperature on lung preservation assessment.J Thorac Cardiovasc Surg,1989,98:333～342.
6，Guanghan Wu MD,Futing Zhang MD,Robert K,Salleg MD,M Clive Robinson,Md,and Sufan Chien,MD A systermatic study of hypothermic lung preservation solutions:Euro-Collins solution.Ann Thorac Surg,1996,62:356～362.
, 百拇医药
7，T.Siminiak,N.A.Flores and D.J.Sheridan Neutrophil interaction with endothelium and platelets:possible role in the development.of cardiovascular injury.European Heart Journal,1995,16:160～170.
8，高连如，刘国仗，赵云源，等.内皮衍生舒张因子合成前体降压机制的研究.中华心血管病杂志，1996，24：245～249.
收稿日期：1999-02-05
修回日期：1999-03-28, 百拇医药
单位：福建医科大学附属协和医院心胸外科 350001
关键词：左旋精氨酸；肺脏保存；动物实验
心肺血管病杂志000222
摘要 观察左旋精氨酸对离体兔肺脏保存的保护作用，健康家兔随机分成对照组(EC组)和实验组(Arg组)，每组15只，EC组兔肺脏予Euro-collins液进行灌洗，Arg组予含左旋精氨酸的EC液进行灌洗肺脏，灌洗总量60 ml/kg，灌注压力20 cm水柱，灌毕完整取下心肺组织浸入保存液4℃环境冷藏，7 h后取肺进行离体复灌，测定肺血管阻力，血气分析，肺血管对Ach舒血管反应性，肺组织湿干重比例及肺组织电镜检查等指标。EC组肺血管阻力，肺组织湿干重比例均高于Arg组，肺血管对Ach反应性EC组较Arg组差，血气指标EC组下降明显，Arg组肺组织形态轻微改变，而EC组水肿明显渗出严重。左旋精氨酸具有改善离体兔肺脏的保存效果。
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The Effect of L-Arginine on Rabbit Lung Preservation
Wang Qimin,Liao Chongxian,Chen Daozhong
(Department of cardiac surgery,Union Hospial Fujian Medical
University,Fuzhou,Fujian 350001)
Abstract The effect of L-Arginine Arg on lung preseration Method: 30 rabbits were divided into Euro-collins(EC)and Arg groups.Lung were flushed with EC solution in EC group,and Args group with Arg solution which contained 0.2 mg/ml L-Arginine.After being flushed the heart-lung blocks were harvested and stored in 4 ℃ cold solution for 7 hours.The lungs were reperfused with flesh venous blood.Pulmonary vascular resistance (PVR),blood gas analysis,achinduced vosodilation.lung tissue wet/dry ratio and histologic changes were observed.Result:the W/D and PVR were higher in EC group than those in Arg group.Ach-induced vosodilation and the vesults of blood gas analysis were better in Arg group than those in EC group.Histologic changes were minimal in Arg group.Conclusion:L-Arginine improved the quality of rabbit lungs preservation,which might be the result of its endothelial protection.
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Key words:L-Arginine; Lung preservation
近年来，随着基础研究的深入，血管内皮细胞的功能日益受到重视，许多证据表明内皮功能损害，一氧化氮(NO)合成减少与组织缺血再灌注损伤关系密切[1]，也发现低温保存后的肺脏血管，内皮功能受损[2]，因此，如何保护肺血管内皮细胞减轻缺血再灌注损伤，成为离体器官保存研究的新课题。外源性左旋精氨酸能够促进内皮细胞的NO合成，对组织缺血再灌注损伤具有保护作用[3～4]，作者在Euro-collins(EC)液中加入左旋精氨酸，观察其对离体兔肺的影响。
材料和方法
1.研究对象及分组 健康家兔30只(由福建医科大学实验动物中心提供)，体重1.7～2.4 kg，按照随机原则，分为对照组(EC组)和实验组(Arg组)，每组15只。EC组应用EC液，Arg组在EC液中加入左旋精氨酸0.2 mg/ml。
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2.实验步骤 兔芬太尼10～20 ug/kg经耳缘静脉注射后，全麻，气管切开，接呼吸机(DH-10型，浙江医科大学)，调节呼吸频率40次/min，潮气量15 ml/kg，予空气通气。兔去毛消毒，前正中线开胸，剪除纵隔胸膜切除胸腺暴露气管，打开心包，游离上下腔静脉，按200单位/kg经右心耳进行肝素化，经右室流出道插入16GA肺动脉灌注管并固定。
结扎上下腔静脉，阻断升主动脉，经肺动脉灌4℃保存液，同时剪开左右心耳，保存液灌注压力控制20 cm水柱，灌注总量60 ml/kg，灌注毕，让肺保持中度膨胀状态，切断气管，取出完整心肺组织，浸入4℃的保存液中继续冷藏，保存7 h，再行离体复灌。
复灌时参照LS Wang模型[5]，取出心肺组织，固定好肺动脉灌注管，灌注管经三通开关一端接压力表，一端连蠕动泵。气管接呼吸机呼吸参数如同前述。复灌采用稀释新鲜静脉血，血球压积25%左右，复灌流量20 ml/min，复灌时间15 min。
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3.指标观察 肺血管阻力(PVR)：于复灌后每隔3 min记录1次，PVR=肺动脉平均压力/流量，单位mm Hg/ml/min。血气分析：取稀释静脉血及复灌后3 min、12 min的肺静脉血1.5 ml进行血气测定，记录血氧分压PvO2单位 mm Hg。肺血管对乙酰胆碱(Ach)舒张的反应性：记录复灌12 min时肺动脉平均压力，然后经肺动脉注入Achl 0～8 mol/kg，观察肺动脉压力变化，取得低数值，根据肺动脉平均压降低的百分数作结果。肺组织湿/干重比例(W/D Ratio)：复灌毕取左肺称重后置80℃干燥箱中烘干，再称重，两者比值为结果。
电镜检查 复灌毕各组随机抽取3例，从右上肺表面取一小块肺组织进行初固定，再切成1 mm 3薄片后固定、脱水、包埋、切片、染色观察。
4.统计学处理 数据结果X±S表示，组间比较用t检验，以P<0.05为统计学上差别有显著意义。
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结 果
1.一般资料 2组间兔的体重，稀释后待灌静脉血的血球压积血氧分压，血pH值，无统计学上的差异。
图1 复灌后肺阻力
图2 复灌后肺静脉血氧分压
2.肺组织湿/干重比例测定结果 EC组为10.5±0.48，Arg组为9.96±0.40 (P<0.05)。
3.肺血管对Ach舒张血管的反应性测定结果 (1)EC组肺动脉推注Ach后，肺动脉平均压降低8.7±0.7%；(2)Arg组肺动脉推注Ach，肺动脉平均压降低15±2.3%。
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4.超微结构改变 EC组：肺泡出血、渗出，可见中性粒细胞浸润；Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞肿胀，线粒体肿胀，内质网扩张，板层体脱落，毛细血管内皮细胞肿胀，细胞间隙增宽，排列疏散，肺泡间质水肿(图3)。Arg组：肺泡未见明显出血、渗出，未见粒细胞浸润；肺泡上皮Ⅰ、Ⅱ型细胞无肿胀粒体结构大致正常，内质网清晰，板层体正常，内皮细胞未见肿胀，可见吞饮现象，细胞间隙正常，基底膜完整，肺间质轻度肿胀(图4)。
图3 EC组 ×12000肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞肿胀，板层体脱落线粒体肿胀，内质网扩张
图4 Arg组 ×8000肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞无肿胀，间质无水肿毛细血管内皮细胞吞饮丰富，基膜完整
讨 论
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在过去30年，人们围绕着供肺保存开展了大量实验研究工作，但至今仍未获得满意的结果，尽管有作者报道，保存12 h甚至18 h后肺功能完好，但临床应用的安全时限仍仅4 h左右，超过此限，将严重影响术后早期的肺功能从而产生更多的并发症及更高的死亡率。因此，提高供肺保存质量，从而延长供肺保存时间，仍是该领域迫切需要解决的课题，Guaghan系统研究了EC液[6]，发现EC液低温保存4 h，肺质量完好，6 h已经受损，8 h则明显损害，根据其研究结果，本课题选择7 h，作为保存时限，以便与实验组进行对照。
本实验显示 L-Arg能够减轻肺组织水肿，与EC组比较，Arg组W/D比值较低；L-Arg能够扩张肺血管降低肺阻力，复灌3 min后，Arg组的PVR均明显低于EC组(P<0.05或P<0.01)；L-Arg能够改善通气/血流比例，实验中可以看出，在复灌后2个时间点，Arg组血氧分压均高于EC组；形态学结果显示：EC组肺泡出血，见大量粒细胞聚集，肺间质水肿，毛细血管充血，内皮细胞肿胀而Arg组肺组织基本正常。上述结果说明，L-Arg能明显改善肺保存的质量。
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L-Arg主要通过促进内皮细胞增加NO合成而发挥药理作用[7]。L-Arg在一氧化氮合成酶(NOS)催化下，产生NO，NO可直接弥散至血管平滑肌细胞，与之结合，激活鸟苷酸环化酶，增加细胞内cGMP浓度，促进Na+-Ca2+转换，使平滑肌松驰，扩张血管。而缺血缺氧肺血管收缩，已被证实L-Arg能够降低缺氧性肺动脉高压，其次L-Arg可以增加内皮细胞抗中性粒细胞(PMN)粘附作用，避免其粘附活化释放有害物质，从而保护肺组织细胞，实验中观察到Arg组肺毛细血管、肺间质及肺胞腔内无明显PMN聚集现象，再者NO能够直接进入血小板，增加cGMP，导致血小板活性降低，聚集力下降，另一方面NO也可抑制PMN释放血小板活化因子使血小板活性减低，从而避免血栓形成。许多实验表明静滴L-Arg可使血浆中的内皮素浓度下降[8]，ET是体内已知缩血管作用最强的物质，肺血管平滑肌和支气管平滑肌细胞均有大量ET受体，缺血缺氧，ET合成增加，使肺血管强烈收缩和支气管痉挛，L-Arg通过增加NO合成抑制ET生成，从而扩张肺动脉，舒张支气管，改善通气/血流比值，提高氧合能力。
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1，David L,Wessel MD，Ian Adatia MB，et al. Use of inhaled nitric oxide and acetylcholine in the evaluation of pulmonary hypertension and endothelial function after CPB.Crculation,1993,88：2128～2138.
2，Kimblad Per Ola MD，Stig steen MD.Pulmonary vascular resistance related to endothelial function after lung transplantation.Ann Thorac Surg,1994,58:416～420.
3，Lihua Xiong MD,Michel Masmanian MD,Chapelier MD,et al.Lung preservation with euro-collins,University of wisconsin,wallwork,and low-potassi-um-dextran solutions.Ann Thorac Surg,1994,58:845～850.
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4，Anderew S,Weyrich PhD,Xiu-Liang Ma MD.PhD;and Allan M.lefer;PhD The Role of L-Arginine in ameliorating reperfusion injury after myocardial ischemia in the cat.Circulation,1992,86:279～288.
5，Liang-shun Wang MD,Koechi yoshikawa MD,Shinichiro Miyoshi MD,et al.The effect of ischemic time and temperature on lung preservation assessment.J Thorac Cardiovasc Surg,1989,98:333～342.
6，Guanghan Wu MD,Futing Zhang MD,Robert K,Salleg MD,M Clive Robinson,Md,and Sufan Chien,MD A systermatic study of hypothermic lung preservation solutions:Euro-Collins solution.Ann Thorac Surg,1996,62:356～362.
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7，T.Siminiak,N.A.Flores and D.J.Sheridan Neutrophil interaction with endothelium and platelets:possible role in the development.of cardiovascular injury.European Heart Journal,1995,16:160～170.
8，高连如，刘国仗，赵云源，等.内皮衍生舒张因子合成前体降压机制的研究.中华心血管病杂志，1996，24：245～249.
收稿日期：1999-02-05
修回日期：1999-03-28, 百拇医药