内皮素和一氧化氮在烧冲复合伤肺损伤中作用的研究
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作者：屈纪富 郑怀恩 林远 古德全 闫国和
单位：屈纪富(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)；郑怀恩(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)；林远(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)；古德全(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)
关键词：内皮素；一氧化氮；烧冲复合伤；肺脏
第三军医大学学报000423 提 要： 目的 探讨内皮素(ET)和一氧化氮(NO) 在大鼠烧冲复合伤肺损伤中的作用机制。方法 大鼠烧冲复合伤后给予E T受体(ETR)拮抗剂和NO合酶(NOS)抑制剂治疗，检测与肺损伤密切相关的指标的变化。结果 烧冲复合伤大鼠血清和肺组织氧自由基丙二醛(MDA)含量、肺组织弹力 纤维(EF)和血管性假血友病因子(vWF)含量均出现了显著变化(P< 0.05)， 给予ETR拮抗剂 和NOS抑制剂治疗分别可减轻和加重这些指标的变化(P< 0.05)。结 论 ET和NO与大鼠烧冲复合伤肺损伤密切相关，它们可通过多种途径影响大鼠烧冲 复合伤肺损伤的发展。
, 百拇医药
中图法分类号： R642;R644 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0376-03
Effects of endothelin and nitric oxide on lung injury after combined bu rn-blast injury in rats
QU Ji-fu, ZHENG Huai-en, LIN Yuan, GU De-quan, YAN Guo-he
(Department of Radiation Medicine, Third Military Medical University, Chongqi ng 400038,China)
Abstract: Objective To explore the machenism of endothelin( ET) and nitric oxide(NO) effect on lung injury after combined burn-blast injury in rats. Methods The indices related to lung injury were measu red after rats were inflicted with combined burn-blast injury and administered with endothelin receptor(ETR) antagonist and nitric oxide synthase(NOS) inhibito r. Results The content of oxygen radical in serum and the lungs w as significantly increased, the amount of pulmonary elastic fiber and von Willeb rand Factor were significantly decreased(P< 0.05) after combined burn-blast injury and these indices were affected with the administration of ETR antagonist and NOS inhibitor K(P< 0.05). Conclusion ET and NO can afftec t the process of lung injury via different pathways after combin ed burn-blast injury in rats.
, 百拇医药
Key words: Endothelin; Nitric oxide; Combined burn-blast in jury; lungs; rat▲
内皮素(Endothelin,ET)和一氧化氮(Nitric oxide,NO)是近来发现的调节血管收缩和舒 张的重要的血管活性物质。作者以往研究发现，大鼠烧冲复合伤后ET和NO含量可出现显著变 化，ETR拮抗剂和NOS抑制剂分别可减轻和加重肺损伤[1]。在此基础上，我们对烧 冲复合伤大鼠应用ETR拮抗剂BQ-123和NOS抑制剂硝基左旋精氨甲酯(L-NAME)治疗，检测与 肺损伤密切相关的指标的变化，以期阐明大鼠烧冲复合伤后ET和NO的作用机制和途径。
1 材料和方法
1.1 动物分组及致伤
健康Wistar大鼠40只，体重150～250 g，雌雄各半。随机分为：①正常组(Normal)；② 烧冲复合伤加L-NAME组(L-NAME)；③对照组(Control)；④烧冲复合伤加BQ-123组(BQ-1 23)，每组10只动物。烧冲复合伤大鼠先用5 kW溴钨灯致15% TBSAⅢ度(病理检查证实)光辐 射烧伤，再用BST-1型生物激波管致冲击伤[超压峰值(429.3±11.5)kPa]，两伤间隔时 间为40～60 min。正常组大鼠不致伤，BQ-123组、对照组和L-NAME组大鼠分别在烧冲复合 伤后立即腹腔注入BQ-123(1 mg/kg体重)、生理盐水(2 ml/只)和L-NAME(10 mg/kg体重) ，给药后4 h活杀取材。
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1.2 检测指标及试剂
常规制作肺脏石蜡切片，并用链霉菌亲生物素蛋白-过化物酶免疫组化染色法(S-P方 法)进行免疫组化染色(按说明书操作)，结合图像分析测量肺组织血管性假血友病因子( Von Willebrand Factor,vWF)含量；肺脏石蜡切片按Weigert's法[2]进行弹力纤维 染色，结合图像分析来检测肺组织弹力纤维(Elastic fiber,EF)含量；血清丙二醛(Malondi aldehyde,MDA)含量的测定按蔡蕾方法[3]进行；肺组织MDA含量的测定按楼淑芬方 法[4]进行。S-P试剂盒和vWF抗体购自福州迈新生物技术开发公司，BQ-123购自 北京医科大学心肺内分泌研究室，L-NAME购自Sigma公司。
1.3 图像分析
从每张肺脏EF染色和vWF免疫组化染色切片中随机选取5个视野，输入TECBIAS-6803真 彩色生物医学图像分析系统，测量其平均积分光密度值(IOD)，以此表示 肺组织EF和vWF含量。
, 百拇医药
1.4 统计学分析
所有数据输入微机，用SPMR统计程序包中的PDA-2程序进行单因素方差分析及均数间的 显著性差异检验。
2 结果
烧冲复合伤大鼠血清和肺组织MDA含量、肺组织EF和vWF含量均出现了显著变化(P< 0. 05)，给予ETR拮抗剂和NOS抑制剂治疗分别可减轻和加重这些指标的变化(P< 0.05)，见表1，2。
表1 ETR拮抗剂、NOS抑制剂对大鼠肺脏EF
和vWF含量的影响
Tab 1 The effects of ETR antagonist, NOS inhibitor on the
, 百拇医药 co ntents of pulmonary EF and vWF in rats
Normal
L-NAME
Control
BQ-123
IOD(EF)
0.084±0.020
0.034±0.008* ▲
0.035±0.003*
0.053±0.024* ▲
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IOD(vWF)
1822.4±70.50
14.6±1.67* ▲
42.6±5.41*
215.4±11.63* ▲
*：P< 0.05 vs normal；▲：P< 0.05 vs control
表2 ETR拮抗剂、NOS抑制剂对大鼠MDA含量的影响
Tab 2 The effects of ETR antagonist, NOS inhibitor on the contents of MDA in rats MDA
, 百拇医药
Normal
L-NAME
Control
BQ-123
Serum(CB/nmol.L-1)
2.990±0.410
7.030±1.0 09* ▲
6.160±1.407*
4.300±3.847▲
Lung(mB/nmol.mg-1)
, 百拇医药
99.953±7.311
209.074 ±32.230* ▲
186.46±13.008*
127.656±16.466▲
*：P< 0.05 vs normal；▲：P< 0.05 vs control
3 讨论
烧冲复合伤大鼠给予ETR拮抗剂和NOS抑制剂后多种与肺损伤有关的指标都发生了显著变 化，这提示ET和NO与烧冲复合伤肺损伤密切相关，其作用机制和途径可能包括以下几个方面 。
3.1 影响氧自由基产生和脂质过氧化损伤
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生物膜中含有大量的多种不饱和脂肪酸，氧自由基很容易从膜的不饱和脂肪酸中抽提氢 而引发脂质过氧化(LPO)反应，而产生LOO.和LOOH.，新生的LOO.和LOOH.一方面继续氧 化不饱和 脂肪酸中的双键，另一方面又可裂解为丙二醛(MDA)，也能破坏蛋白、酶、磷脂和核酸的分 子结构[5]。MDA含量是间接反映氧自由基含量及其引发的LPO损伤的常用指标 [6]。我们发现，大鼠烧冲复合伤后氧自由基含量显著增多，给予ETR拮抗剂BQ-123治 疗后氧自由基含量明显减少，而NOS抑制剂L-NAME可使氧自由基含量增多更明显，提示ET和 NO S可通过氧自由基和LPO途径影响烧冲复合伤肺损伤的发展。这是由于ET和NO是调节血管收缩 和舒张的血管活性物质，烧冲复合伤后肺组织ET/NO比值升高将使肺血管收缩作用增强，肺 脏出现缺血缺氧性改变[1]，缺血及其随后发生的再灌流将使氧自由基含量增加，L PO损伤加重；ET和NO还可通过中性粒细胞(PMNs)途径加重LPO损伤；另外，ET也可通过直接 和间接途径使氧自由基含量增加[7]。
, 百拇医药
3.2 影响血管内皮细胞和血管通透性
血管内皮细胞(VEC)受损将使vWF释放减少，因此vWF含量可间接反映VEC受损程度[ 8]。我们发现，烧冲复合伤大鼠肺组织vWF含量显著减少，给予ETR拮抗剂和NOS抑制剂治 疗分别可减轻和加重其变化，提示烧冲复合伤后VEC出现了明显损伤，ET和NO分别可加重和 减轻VEC损伤，这可能是由于细胞毒作用[9]， 也可能是通过炎症介质或炎症细胞(如PMNs等)间接起作用，其具体原因有待于进一步研究。 VEC是ET和NO合成、分泌的主要细胞，其受损后将会影响ET和NO的含量，而ET和NO又可影响V EC受损程度，烧冲复合伤后ET和NO含量变化与VEC受损将相互影响，并形成恶性循环，使血 管通透性增加，加重肺损伤。
3.3 直接损伤肺组织
EF是肺组织中的一种重要的结构成分，其含量可反映肺损伤程度[10]。烧冲复 合伤大鼠肺组织EF含量显著减少，ETR拮抗剂BQ-123和NOS抑制剂L-NAME可显著减轻和 加重 这种变化，这证实ET和NO可影响大鼠烧冲复合伤肺损伤。烧冲复合伤后肺组织EF含量显著减 少是由于肺血管内PMNs数量显著增多所致，因为PMNs可释放各种酶如弹性蛋白酶等，降解弹 性蛋白，破坏弹力纤维等结构成分，使肺泡扩张，血管通透性增加，肺损伤加重[10] 。
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作者简介：屈纪富(1969-)，男，四川省乐至县人，博士研究生，主治医师，讲师，主要从事创伤及感染性休克方面的研究，发表论文10篇，现在附属西南医院 急救部工作。电话：(023)68754000-73042
作者单位：闫国和(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)
参考文献：
[1] 屈纪富，郑怀恩，林 远，等.烧冲复合伤后内皮素和一氧化氮的变 化及其意义[J].第三军医大学学报，1998，20(4)：314-316.
[2] 凌启波 主编.实用病理特殊染色和组化技术[M].广州：广东高等教育出版 社，1989.19-22.
[3] 蔡 蕾，奚为乎，余嘉丽，等.过氧化脂质荧光测定法的一些干扰因素观察[ J].临床检验杂志，1986，4(4)：170-171,175.
, 百拇医药
[4] 楼淑芬，陈宗荣.烧伤焦痂脂类引起大鼠肝线粒体脂质过氧化的实验研究[J ].第三军医大学学报，1995，17(5)：387-388.
[5] Hsu K, Wang D, Wu S Y, et al. Ischemia-reperfusion lung inju ry attenuated by ATP-MgCl2 in rats[J]. J Appl Physiol,1994,76(2):545-552.
[6] Gardner T J. Oxygen radicals and myocardial stunning[J]. J Card S urg,1994,9(3 Suppl):422-424.
[7] Lopez F A, Riesco A, Espinosa G, et al. Effect of endothe lin- 1 on neutrophil adhesion to endothelial cells[J]. Circulation,1993,88(3):1 166 -1 171.
, 百拇医药
[8] 屈纪富，郑怀恩，林 远，等.烧伤、冲击伤和烧冲复合伤后内皮素和血管性 假血友病因子含量的变化及其意义[J].第三军医大学学报，1996，18(6)：525-527.
[9] Stawski G, Olsen U B, Grande P. Cytotoxic effect of endothelin-1 d uring “simulated” ischemia in cultured rat myocytes[J]. Eur J Pharmacol,1991 ,201(1):123-124
[10] Qu Jifu, Zhang Huaien, Lin Yuang, et al. Study on the changes and significances of vWF and elastic fiber after combined burn-blas t injury [M]. Chongqing：Chongqing Publishing House,1996.355-356.
收稿日期：1999-03-08；修回日期：1999-08-06, http://www.100md.com
单位：屈纪富(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)；郑怀恩(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)；林远(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)；古德全(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)
关键词：内皮素；一氧化氮；烧冲复合伤；肺脏
第三军医大学学报000423 提 要： 目的 探讨内皮素(ET)和一氧化氮(NO) 在大鼠烧冲复合伤肺损伤中的作用机制。方法 大鼠烧冲复合伤后给予E T受体(ETR)拮抗剂和NO合酶(NOS)抑制剂治疗，检测与肺损伤密切相关的指标的变化。结果 烧冲复合伤大鼠血清和肺组织氧自由基丙二醛(MDA)含量、肺组织弹力 纤维(EF)和血管性假血友病因子(vWF)含量均出现了显著变化(P< 0.05)， 给予ETR拮抗剂 和NOS抑制剂治疗分别可减轻和加重这些指标的变化(P< 0.05)。结 论 ET和NO与大鼠烧冲复合伤肺损伤密切相关，它们可通过多种途径影响大鼠烧冲 复合伤肺损伤的发展。
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中图法分类号： R642;R644 文献标识码：A
文章编号：1000-5404(2000)04-0376-03
Effects of endothelin and nitric oxide on lung injury after combined bu rn-blast injury in rats
QU Ji-fu, ZHENG Huai-en, LIN Yuan, GU De-quan, YAN Guo-he
(Department of Radiation Medicine, Third Military Medical University, Chongqi ng 400038,China)
Abstract: Objective To explore the machenism of endothelin( ET) and nitric oxide(NO) effect on lung injury after combined burn-blast injury in rats. Methods The indices related to lung injury were measu red after rats were inflicted with combined burn-blast injury and administered with endothelin receptor(ETR) antagonist and nitric oxide synthase(NOS) inhibito r. Results The content of oxygen radical in serum and the lungs w as significantly increased, the amount of pulmonary elastic fiber and von Willeb rand Factor were significantly decreased(P< 0.05) after combined burn-blast injury and these indices were affected with the administration of ETR antagonist and NOS inhibitor K(P< 0.05). Conclusion ET and NO can afftec t the process of lung injury via different pathways after combin ed burn-blast injury in rats.
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Key words: Endothelin; Nitric oxide; Combined burn-blast in jury; lungs; rat▲
内皮素(Endothelin,ET)和一氧化氮(Nitric oxide,NO)是近来发现的调节血管收缩和舒 张的重要的血管活性物质。作者以往研究发现，大鼠烧冲复合伤后ET和NO含量可出现显著变 化，ETR拮抗剂和NOS抑制剂分别可减轻和加重肺损伤[1]。在此基础上，我们对烧 冲复合伤大鼠应用ETR拮抗剂BQ-123和NOS抑制剂硝基左旋精氨甲酯(L-NAME)治疗，检测与 肺损伤密切相关的指标的变化，以期阐明大鼠烧冲复合伤后ET和NO的作用机制和途径。
1 材料和方法
1.1 动物分组及致伤
健康Wistar大鼠40只，体重150～250 g，雌雄各半。随机分为：①正常组(Normal)；② 烧冲复合伤加L-NAME组(L-NAME)；③对照组(Control)；④烧冲复合伤加BQ-123组(BQ-1 23)，每组10只动物。烧冲复合伤大鼠先用5 kW溴钨灯致15% TBSAⅢ度(病理检查证实)光辐 射烧伤，再用BST-1型生物激波管致冲击伤[超压峰值(429.3±11.5)kPa]，两伤间隔时 间为40～60 min。正常组大鼠不致伤，BQ-123组、对照组和L-NAME组大鼠分别在烧冲复合 伤后立即腹腔注入BQ-123(1 mg/kg体重)、生理盐水(2 ml/只)和L-NAME(10 mg/kg体重) ，给药后4 h活杀取材。
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1.2 检测指标及试剂
常规制作肺脏石蜡切片，并用链霉菌亲生物素蛋白-过化物酶免疫组化染色法(S-P方 法)进行免疫组化染色(按说明书操作)，结合图像分析测量肺组织血管性假血友病因子( Von Willebrand Factor,vWF)含量；肺脏石蜡切片按Weigert's法[2]进行弹力纤维 染色，结合图像分析来检测肺组织弹力纤维(Elastic fiber,EF)含量；血清丙二醛(Malondi aldehyde,MDA)含量的测定按蔡蕾方法[3]进行；肺组织MDA含量的测定按楼淑芬方 法[4]进行。S-P试剂盒和vWF抗体购自福州迈新生物技术开发公司，BQ-123购自 北京医科大学心肺内分泌研究室，L-NAME购自Sigma公司。
1.3 图像分析
从每张肺脏EF染色和vWF免疫组化染色切片中随机选取5个视野，输入TECBIAS-6803真 彩色生物医学图像分析系统，测量其平均积分光密度值(IOD)，以此表示 肺组织EF和vWF含量。
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1.4 统计学分析
所有数据输入微机，用SPMR统计程序包中的PDA-2程序进行单因素方差分析及均数间的 显著性差异检验。
2 结果
烧冲复合伤大鼠血清和肺组织MDA含量、肺组织EF和vWF含量均出现了显著变化(P< 0. 05)，给予ETR拮抗剂和NOS抑制剂治疗分别可减轻和加重这些指标的变化(P< 0.05)，见表1，2。
表1 ETR拮抗剂、NOS抑制剂对大鼠肺脏EF
和vWF含量的影响
Tab 1 The effects of ETR antagonist, NOS inhibitor on the
, 百拇医药 co ntents of pulmonary EF and vWF in rats
Normal
L-NAME
Control
BQ-123
IOD(EF)
0.084±0.020
0.034±0.008* ▲
0.035±0.003*
0.053±0.024* ▲
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IOD(vWF)
1822.4±70.50
14.6±1.67* ▲
42.6±5.41*
215.4±11.63* ▲
*：P< 0.05 vs normal；▲：P< 0.05 vs control
表2 ETR拮抗剂、NOS抑制剂对大鼠MDA含量的影响
Tab 2 The effects of ETR antagonist, NOS inhibitor on the contents of MDA in rats MDA
, 百拇医药
Normal
L-NAME
Control
BQ-123
Serum(CB/nmol.L-1)
2.990±0.410
7.030±1.0 09* ▲
6.160±1.407*
4.300±3.847▲
Lung(mB/nmol.mg-1)
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99.953±7.311
209.074 ±32.230* ▲
186.46±13.008*
127.656±16.466▲
*：P< 0.05 vs normal；▲：P< 0.05 vs control
3 讨论
烧冲复合伤大鼠给予ETR拮抗剂和NOS抑制剂后多种与肺损伤有关的指标都发生了显著变 化，这提示ET和NO与烧冲复合伤肺损伤密切相关，其作用机制和途径可能包括以下几个方面 。
3.1 影响氧自由基产生和脂质过氧化损伤
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生物膜中含有大量的多种不饱和脂肪酸，氧自由基很容易从膜的不饱和脂肪酸中抽提氢 而引发脂质过氧化(LPO)反应，而产生LOO.和LOOH.，新生的LOO.和LOOH.一方面继续氧 化不饱和 脂肪酸中的双键，另一方面又可裂解为丙二醛(MDA)，也能破坏蛋白、酶、磷脂和核酸的分 子结构[5]。MDA含量是间接反映氧自由基含量及其引发的LPO损伤的常用指标 [6]。我们发现，大鼠烧冲复合伤后氧自由基含量显著增多，给予ETR拮抗剂BQ-123治 疗后氧自由基含量明显减少，而NOS抑制剂L-NAME可使氧自由基含量增多更明显，提示ET和 NO S可通过氧自由基和LPO途径影响烧冲复合伤肺损伤的发展。这是由于ET和NO是调节血管收缩 和舒张的血管活性物质，烧冲复合伤后肺组织ET/NO比值升高将使肺血管收缩作用增强，肺 脏出现缺血缺氧性改变[1]，缺血及其随后发生的再灌流将使氧自由基含量增加，L PO损伤加重；ET和NO还可通过中性粒细胞(PMNs)途径加重LPO损伤；另外，ET也可通过直接 和间接途径使氧自由基含量增加[7]。
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3.2 影响血管内皮细胞和血管通透性
血管内皮细胞(VEC)受损将使vWF释放减少，因此vWF含量可间接反映VEC受损程度[ 8]。我们发现，烧冲复合伤大鼠肺组织vWF含量显著减少，给予ETR拮抗剂和NOS抑制剂治 疗分别可减轻和加重其变化，提示烧冲复合伤后VEC出现了明显损伤，ET和NO分别可加重和 减轻VEC损伤，这可能是由于细胞毒作用[9]， 也可能是通过炎症介质或炎症细胞(如PMNs等)间接起作用，其具体原因有待于进一步研究。 VEC是ET和NO合成、分泌的主要细胞，其受损后将会影响ET和NO的含量，而ET和NO又可影响V EC受损程度，烧冲复合伤后ET和NO含量变化与VEC受损将相互影响，并形成恶性循环，使血 管通透性增加，加重肺损伤。
3.3 直接损伤肺组织
EF是肺组织中的一种重要的结构成分，其含量可反映肺损伤程度[10]。烧冲复 合伤大鼠肺组织EF含量显著减少，ETR拮抗剂BQ-123和NOS抑制剂L-NAME可显著减轻和 加重 这种变化，这证实ET和NO可影响大鼠烧冲复合伤肺损伤。烧冲复合伤后肺组织EF含量显著减 少是由于肺血管内PMNs数量显著增多所致，因为PMNs可释放各种酶如弹性蛋白酶等，降解弹 性蛋白，破坏弹力纤维等结构成分，使肺泡扩张，血管通透性增加，肺损伤加重[10] 。
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作者简介：屈纪富(1969-)，男，四川省乐至县人，博士研究生，主治医师，讲师，主要从事创伤及感染性休克方面的研究，发表论文10篇，现在附属西南医院 急救部工作。电话：(023)68754000-73042
作者单位：闫国和(第三军医大学预防医 学系防原医学教研室、全军复合伤研究所，重庆 400038)
参考文献：
[1] 屈纪富，郑怀恩，林 远，等.烧冲复合伤后内皮素和一氧化氮的变 化及其意义[J].第三军医大学学报，1998，20(4)：314-316.
[2] 凌启波 主编.实用病理特殊染色和组化技术[M].广州：广东高等教育出版 社，1989.19-22.
[3] 蔡 蕾，奚为乎，余嘉丽，等.过氧化脂质荧光测定法的一些干扰因素观察[ J].临床检验杂志，1986，4(4)：170-171,175.
, 百拇医药
[4] 楼淑芬，陈宗荣.烧伤焦痂脂类引起大鼠肝线粒体脂质过氧化的实验研究[J ].第三军医大学学报，1995，17(5)：387-388.
[5] Hsu K, Wang D, Wu S Y, et al. Ischemia-reperfusion lung inju ry attenuated by ATP-MgCl2 in rats[J]. J Appl Physiol,1994,76(2):545-552.
[6] Gardner T J. Oxygen radicals and myocardial stunning[J]. J Card S urg,1994,9(3 Suppl):422-424.
[7] Lopez F A, Riesco A, Espinosa G, et al. Effect of endothe lin- 1 on neutrophil adhesion to endothelial cells[J]. Circulation,1993,88(3):1 166 -1 171.
, 百拇医药
[8] 屈纪富，郑怀恩，林 远，等.烧伤、冲击伤和烧冲复合伤后内皮素和血管性 假血友病因子含量的变化及其意义[J].第三军医大学学报，1996，18(6)：525-527.
[9] Stawski G, Olsen U B, Grande P. Cytotoxic effect of endothelin-1 d uring “simulated” ischemia in cultured rat myocytes[J]. Eur J Pharmacol,1991 ,201(1):123-124
[10] Qu Jifu, Zhang Huaien, Lin Yuang, et al. Study on the changes and significances of vWF and elastic fiber after combined burn-blas t injury [M]. Chongqing：Chongqing Publishing House,1996.355-356.
收稿日期：1999-03-08；修回日期：1999-08-06, http://www.100md.com