犬副流感弱毒株的分离与鉴定
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37c医学网
作者：金昌德 李六金 李秦 施新猷 张海 娄清林 押宗保
单位：金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李秦(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；娄清林(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；押宗保(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬副流感病毒；弱毒；分离；鉴定
第四军医大学学报000624 摘要:目的 分离并鉴定犬副流感弱毒株，供疫苗制备. 方法 根据犬副流感的血球吸附特性、细胞培养特性以及异种病毒抗血清阻断法分离病毒(简称为CPIV-XN4病毒). 并对其进行形态学、生物学特性等系统鉴定. 结果 病毒分离后其毒力可达10-6 TCID50. 在电镜下可见较典型的犬副流感病毒形态结构特征；免疫电镜下见到抗体分子已被吸附在病毒颗粒表面；在几种细胞上盲传结果MDCK和Vero细胞出现程度不同的病变(CPE)；血清中和抗体效价(SN)可达149.62；CPIV-XN4与国际标准毒株D-008之间有交叉中和反应；病毒接种到健康幼犬后15 d内未发现仔犬死亡；攻毒实验结果，对照组有2条在攻毒后9 d出现神经症状，第14日衰竭而死，实验组动物均未出现临床症状. 结论 CPIV-XN4毒株为制备疫苗的候选毒株.
, 百拇医药
中图号:S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0722-03
Isolation and identification of canine parainfluenza attenuated vaccine strain
JIN Chang-De LI Liu-Jin LI Qin SHI Xin-You ZHANG Hai LOU Qing-Lin YA Zhong-Bao
(Laboratory Animal Research Center， Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract:AIM To produce the vaccine, we isolated a strain of canine parainfluenza attenuated virus. METHODS According to the cellular adsorptive and cultural properties of the canine parainfluenza virus, we isolated the virus named CPIV-XN4,by heterovirus anti-serum blocking test. We also identified its morphological and biological characteristics. RESULTS The titer of the virus was 10-6 TCID50. There could be seen the typical canine parainfluenza virus particles under the electron microscope. The antibody molecules had been absorbed in the surface of the virus particle, which was observed under the immuno-electron microscope. The neutralized antibody titer was 149.62; CPIV-XN4 had a cross-neutralized reaction with the international standard strain. There were no deaths 15 days after incobulation in health infant dogs. The attack results showed that two dogs of the control group had nerve symptoms on the 9th day and died 14 days later. No dogs showed any clinical symptoms in the experiment group. CONCLUSION CPIV-XN4 could be a candidate for vaccine strain.
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Keywords:canine parainfluenza virus; attenuated virus; isolate; identify
0 引言
犬副流感病毒是引起犬上呼吸道感染和脑脊髓炎的传染性疾病的主要病因. 近几年，国外文献报道[1]，犬副流感病毒对犬、狐、貉的神经系统有较强的感染力，病情严重可导致死亡. 从而严重影响犬和狐等养殖业的发展. 国外已有预防犬副流感、犬瘟热、犬细小病毒、犬腺2型组合成犬用4联疫苗用于临床[2]. 我们从四联弱毒样品中将副流感弱毒分离、筛选，并进行了系统鉴定.
1 材料和方法
1.1 病毒 犬四联弱毒样品由西北农林大学预防兽医学院李健强教授馈赠，攻击用犬副流感强毒(CPIV-XN934)由本实验室从犬副流感病犬分离成功，并通过鉴定证明与美国标准毒株D-008具有抗原同一性，D-008标准毒株从美国Fort Dodge 公司购进.
, 百拇医药
1.2 免疫血清 D-008标准兔抗免疫血清从美国Fort Dodge 公司购进，兔抗犬瘟热、兔抗细小病毒血清由本实验室制备.
1.3 传代细胞 MDCK,Vero,F81, MA104,IBRS,PK传代细胞从美国ATCC购买. 1.4 实验动物 选7窝共48条2 mo龄健康断奶幼犬.
1.5 病毒分离 取4支犬四联弱毒样品，每支用1 mL灭菌三蒸水溶解，冻融一次之后静置4～8℃ 5 h，使其分层，然后取中间层0.5 mL. 按50 mL的剂量加入先锋霉素，再按1/5量加入兔抗犬瘟热和兔抗犬细小病毒高免血清，37℃作用30 min后用微型滤器(滤膜孔径为0.22 mm)过滤，然后利用豚鼠红细胞对滤液作吸附浓缩，使弱毒样品中的病毒颗粒吸附到红细胞膜上，以1000 r*min-1离心10 min，取沉淀物，用Hank’s液按1∶1,1∶2,1∶4,1∶8及1∶10稀释后置-20℃冻存备用. 将上述处理好的样品冻融两次后，按营养液的1/10量接种在Vero细胞单层，次日换液，观察8～10 d，待出现CPE以后收集培养液，在-20℃冻存备用.
, 百拇医药
1.6 病毒鉴定
1.6.1 细胞敏感性试验 将分离的CPIV-XN4株分别接种在MDCK,Vero,F81,MA104,IBRS,PK等传代细胞单层，每瓶按培养液1/4量加入10 mL*L-1豚鼠红细胞悬液，4℃作用20 min，然后加入少量的Hank’s液轻轻刷洗2次，倾去悬浮的红细胞后，置显微镜下观察细胞对豚鼠红细胞的吸附能力. 然后加培养液，37℃静置培养，逐日观察细胞病变.
1.6.2 电镜观察 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液10 mL作为负染样品，按常规方法负染色.
1.6.3 免疫电镜观察 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液5 mL，加0.1 mL兔抗CPIV高免血清，混匀后在37℃温室中感作60 min，以4000 r*min-1离心15 min，弃上清，取沉淀物，用1滴蒸馏水悬浮，按常规法负染色，电镜观察.
, 百拇医药
1.6.4 病毒TCID50测定 按10-1～10-8量将CPIV-XN4株接种在Vero细胞单层上，于37℃培养，逐日观察细胞CPE，以50%以上细胞病变作为阳性判定标准.
1.6.5 中和试验 按固定病毒-稀释血清法进行. 即连续2倍稀释标准血清，稀释到1024倍. 每个稀释度以0.25 mL标准血清与CPIV-XN4混合感作1 h，在室温条件下取0.25 mL混合液加到Vero细胞单层上，34～37℃静置培养4～10 d，逐日观察CPE. 测定中和抗体效价.
1.6.6 交叉中和试验 将CPIV-XN4株与D-008标准毒株稀释到10-4. 将两毒株相对应的抗血清分别以10倍连续稀释到10-7. 每个稀释度抗血清0.25 mL与标准对应抗原交叉混合，置37℃作用1 h，观察CPE，测定中和抗体效价.
, 百拇医药
2 结果
2.1 病毒分离培养及TCID50测定 病毒样品接种Vero细胞后，于第8日开始出现细胞病变，其TCID50为10-6.5.
2.2 病毒鉴定
2.2.1 细胞敏感性试验 CPIV-XN4株除了在Vero和MDCK细胞上增殖良好，而其余细胞均未出现CPE.
2.2.2 中和试验 1∶16～1∶256的5个梯度血清和CPIV-XN4株作用后，其复合物在Vero细胞单层上均未出现CPE，中和抗体效价为149.62.
2.2.3 交叉中和试验 如Tab 1所示.
, 百拇医药 表 1 CPIV-XN4和D-008标准毒株的交叉试验
Tab 3 Assay of cross-neutralization between CPIV-XN4 and D-008 standard virus Antibody
virus titer(TCID50)
D-008standard
virus strain
CPIV-XN4
anti-D-008
10-7
, 百拇医药
10-6
anti-CPIV-XN4
10-6
10-6
2.2.4 电镜观察 CPIV-XN4样品中，观察到形态多样、大小不等的病毒颗粒. 其直径在50～300 nm之间. 由于病毒颗粒完整无损，PTA负染液浸入其内，使病毒外形呈白色，并在其表面有密集而整齐的纤突结构，但有的粒子已破裂，PTA浸入内部，可见粒子内部的螺旋对称的核衣壳(Fig 1).
2.2.5 免疫电镜观察 CPIV-XN4株与兔抗副流感弱毒的高免血清作用后，形成抗原-抗体复合物，镜下可见抗体分子已被吸附在CPIV-XN4表面，使该颗粒的纤突层加宽加厚，呈现不规整的外观(Fig 2)，有时可见病毒粒子破裂，其内核衣壳溢出现象(Fig 3).
, 百拇医药
3 讨论
病毒分离过程中，加兔抗犬瘟热和兔抗犬细小病毒高免血清，能够中和4联弱毒样品中的犬瘟热和犬细小病毒. 因腺病毒2型对豚鼠红细胞没有吸附特性和血凝特性，而副流感对豚鼠红细胞具有较强的吸附能力[3]，因此经豚鼠红细胞处理后，样品中基本上只存在犬副流感病毒. 再利用腺病毒2型不能在Vero细胞生长的培养特性，将经抗血清和红细胞处理过的样品在Vero细胞上培养几代，成功分离出犬副流感XN4毒株.
通过电镜和免疫电镜观察、血清中和试验、交叉中和试验以及安全试验和攻毒实验证实了该病毒具有犬副流感病毒的基本结构特征，能够产生较强的免疫力，并与国际标准毒株D-008具有抗原同一性，且该毒株对犬安全可靠，说明本毒株可作为制备弱毒疫苗的种毒.
图 1 犬副流感病毒粒子
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Fig 1 Canine parainfluenza virus particles
图 2 犬副流感病毒免疫电镜图像
Fig 2 Canine parainfluenza virus particles, there could be seen antibody adhering to the surface of virus particles, making the spike thicken ×12K
图 3 犬副流感病毒破裂粒子
Fig 3 Parainfluenza virus broken particle, there could be seen the nucleocapsid in the particle hydrops
, 百拇医药
基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：金昌德(1968-),男(朝鲜族),吉林省延吉市人. 硕士生(导师施新猷)，讲师. Tel.(029)5252978 Email.jcd6811@pub.xaonline.com
参考文献:
[1] Davidson WR, Appel MJ, Doster GL et al. Diseases and parasites of red foxes, gray foxes, and coyotes from commercial sources selling to fox-chasing enclosures[J]. J WILDL Dis, 1992; 28(4): 581-589.
[2] Baumgartner W, Krakowka S, Blakeslee JR. Persistent infection of Vero cells by paramyxoviruses. A morphological and immunoelectron microscopic investigation[J]. Intervirology, 1987; 27(4): 218-223.
[3] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版. 北京：科学出版社出版， 1997：204-437.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-01-10, 百拇医药
单位：金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李秦(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；娄清林(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；押宗保(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬副流感病毒；弱毒；分离；鉴定
第四军医大学学报000624 摘要:目的 分离并鉴定犬副流感弱毒株，供疫苗制备. 方法 根据犬副流感的血球吸附特性、细胞培养特性以及异种病毒抗血清阻断法分离病毒(简称为CPIV-XN4病毒). 并对其进行形态学、生物学特性等系统鉴定. 结果 病毒分离后其毒力可达10-6 TCID50. 在电镜下可见较典型的犬副流感病毒形态结构特征；免疫电镜下见到抗体分子已被吸附在病毒颗粒表面；在几种细胞上盲传结果MDCK和Vero细胞出现程度不同的病变(CPE)；血清中和抗体效价(SN)可达149.62；CPIV-XN4与国际标准毒株D-008之间有交叉中和反应；病毒接种到健康幼犬后15 d内未发现仔犬死亡；攻毒实验结果，对照组有2条在攻毒后9 d出现神经症状，第14日衰竭而死，实验组动物均未出现临床症状. 结论 CPIV-XN4毒株为制备疫苗的候选毒株.
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中图号:S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0722-03
Isolation and identification of canine parainfluenza attenuated vaccine strain
JIN Chang-De LI Liu-Jin LI Qin SHI Xin-You ZHANG Hai LOU Qing-Lin YA Zhong-Bao
(Laboratory Animal Research Center， Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract:AIM To produce the vaccine, we isolated a strain of canine parainfluenza attenuated virus. METHODS According to the cellular adsorptive and cultural properties of the canine parainfluenza virus, we isolated the virus named CPIV-XN4,by heterovirus anti-serum blocking test. We also identified its morphological and biological characteristics. RESULTS The titer of the virus was 10-6 TCID50. There could be seen the typical canine parainfluenza virus particles under the electron microscope. The antibody molecules had been absorbed in the surface of the virus particle, which was observed under the immuno-electron microscope. The neutralized antibody titer was 149.62; CPIV-XN4 had a cross-neutralized reaction with the international standard strain. There were no deaths 15 days after incobulation in health infant dogs. The attack results showed that two dogs of the control group had nerve symptoms on the 9th day and died 14 days later. No dogs showed any clinical symptoms in the experiment group. CONCLUSION CPIV-XN4 could be a candidate for vaccine strain.
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Keywords:canine parainfluenza virus; attenuated virus; isolate; identify
0 引言
犬副流感病毒是引起犬上呼吸道感染和脑脊髓炎的传染性疾病的主要病因. 近几年，国外文献报道[1]，犬副流感病毒对犬、狐、貉的神经系统有较强的感染力，病情严重可导致死亡. 从而严重影响犬和狐等养殖业的发展. 国外已有预防犬副流感、犬瘟热、犬细小病毒、犬腺2型组合成犬用4联疫苗用于临床[2]. 我们从四联弱毒样品中将副流感弱毒分离、筛选，并进行了系统鉴定.
1 材料和方法
1.1 病毒 犬四联弱毒样品由西北农林大学预防兽医学院李健强教授馈赠，攻击用犬副流感强毒(CPIV-XN934)由本实验室从犬副流感病犬分离成功，并通过鉴定证明与美国标准毒株D-008具有抗原同一性，D-008标准毒株从美国Fort Dodge 公司购进.
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1.2 免疫血清 D-008标准兔抗免疫血清从美国Fort Dodge 公司购进，兔抗犬瘟热、兔抗细小病毒血清由本实验室制备.
1.3 传代细胞 MDCK,Vero,F81, MA104,IBRS,PK传代细胞从美国ATCC购买. 1.4 实验动物 选7窝共48条2 mo龄健康断奶幼犬.
1.5 病毒分离 取4支犬四联弱毒样品，每支用1 mL灭菌三蒸水溶解，冻融一次之后静置4～8℃ 5 h，使其分层，然后取中间层0.5 mL. 按50 mL的剂量加入先锋霉素，再按1/5量加入兔抗犬瘟热和兔抗犬细小病毒高免血清，37℃作用30 min后用微型滤器(滤膜孔径为0.22 mm)过滤，然后利用豚鼠红细胞对滤液作吸附浓缩，使弱毒样品中的病毒颗粒吸附到红细胞膜上，以1000 r*min-1离心10 min，取沉淀物，用Hank’s液按1∶1,1∶2,1∶4,1∶8及1∶10稀释后置-20℃冻存备用. 将上述处理好的样品冻融两次后，按营养液的1/10量接种在Vero细胞单层，次日换液，观察8～10 d，待出现CPE以后收集培养液，在-20℃冻存备用.
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1.6 病毒鉴定
1.6.1 细胞敏感性试验 将分离的CPIV-XN4株分别接种在MDCK,Vero,F81,MA104,IBRS,PK等传代细胞单层，每瓶按培养液1/4量加入10 mL*L-1豚鼠红细胞悬液，4℃作用20 min，然后加入少量的Hank’s液轻轻刷洗2次，倾去悬浮的红细胞后，置显微镜下观察细胞对豚鼠红细胞的吸附能力. 然后加培养液，37℃静置培养，逐日观察细胞病变.
1.6.2 电镜观察 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液10 mL作为负染样品，按常规方法负染色.
1.6.3 免疫电镜观察 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液5 mL，加0.1 mL兔抗CPIV高免血清，混匀后在37℃温室中感作60 min，以4000 r*min-1离心15 min，弃上清，取沉淀物，用1滴蒸馏水悬浮，按常规法负染色，电镜观察.
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1.6.4 病毒TCID50测定 按10-1～10-8量将CPIV-XN4株接种在Vero细胞单层上，于37℃培养，逐日观察细胞CPE，以50%以上细胞病变作为阳性判定标准.
1.6.5 中和试验 按固定病毒-稀释血清法进行. 即连续2倍稀释标准血清，稀释到1024倍. 每个稀释度以0.25 mL标准血清与CPIV-XN4混合感作1 h，在室温条件下取0.25 mL混合液加到Vero细胞单层上，34～37℃静置培养4～10 d，逐日观察CPE. 测定中和抗体效价.
1.6.6 交叉中和试验 将CPIV-XN4株与D-008标准毒株稀释到10-4. 将两毒株相对应的抗血清分别以10倍连续稀释到10-7. 每个稀释度抗血清0.25 mL与标准对应抗原交叉混合，置37℃作用1 h，观察CPE，测定中和抗体效价.
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2 结果
2.1 病毒分离培养及TCID50测定 病毒样品接种Vero细胞后，于第8日开始出现细胞病变，其TCID50为10-6.5.
2.2 病毒鉴定
2.2.1 细胞敏感性试验 CPIV-XN4株除了在Vero和MDCK细胞上增殖良好，而其余细胞均未出现CPE.
2.2.2 中和试验 1∶16～1∶256的5个梯度血清和CPIV-XN4株作用后，其复合物在Vero细胞单层上均未出现CPE，中和抗体效价为149.62.
2.2.3 交叉中和试验 如Tab 1所示.
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Tab 3 Assay of cross-neutralization between CPIV-XN4 and D-008 standard virus Antibody
virus titer(TCID50)
D-008standard
virus strain
CPIV-XN4
anti-D-008
10-7
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10-6
anti-CPIV-XN4
10-6
10-6
2.2.4 电镜观察 CPIV-XN4样品中，观察到形态多样、大小不等的病毒颗粒. 其直径在50～300 nm之间. 由于病毒颗粒完整无损，PTA负染液浸入其内，使病毒外形呈白色，并在其表面有密集而整齐的纤突结构，但有的粒子已破裂，PTA浸入内部，可见粒子内部的螺旋对称的核衣壳(Fig 1).
2.2.5 免疫电镜观察 CPIV-XN4株与兔抗副流感弱毒的高免血清作用后，形成抗原-抗体复合物，镜下可见抗体分子已被吸附在CPIV-XN4表面，使该颗粒的纤突层加宽加厚，呈现不规整的外观(Fig 2)，有时可见病毒粒子破裂，其内核衣壳溢出现象(Fig 3).
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3 讨论
病毒分离过程中，加兔抗犬瘟热和兔抗犬细小病毒高免血清，能够中和4联弱毒样品中的犬瘟热和犬细小病毒. 因腺病毒2型对豚鼠红细胞没有吸附特性和血凝特性，而副流感对豚鼠红细胞具有较强的吸附能力[3]，因此经豚鼠红细胞处理后，样品中基本上只存在犬副流感病毒. 再利用腺病毒2型不能在Vero细胞生长的培养特性，将经抗血清和红细胞处理过的样品在Vero细胞上培养几代，成功分离出犬副流感XN4毒株.
通过电镜和免疫电镜观察、血清中和试验、交叉中和试验以及安全试验和攻毒实验证实了该病毒具有犬副流感病毒的基本结构特征，能够产生较强的免疫力，并与国际标准毒株D-008具有抗原同一性，且该毒株对犬安全可靠，说明本毒株可作为制备弱毒疫苗的种毒.
图 1 犬副流感病毒粒子
, http://www.100md.com
Fig 1 Canine parainfluenza virus particles
图 2 犬副流感病毒免疫电镜图像
Fig 2 Canine parainfluenza virus particles, there could be seen antibody adhering to the surface of virus particles, making the spike thicken ×12K
图 3 犬副流感病毒破裂粒子
Fig 3 Parainfluenza virus broken particle, there could be seen the nucleocapsid in the particle hydrops
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基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：金昌德(1968-),男(朝鲜族),吉林省延吉市人. 硕士生(导师施新猷)，讲师. Tel.(029)5252978 Email.jcd6811@pub.xaonline.com
参考文献:
[1] Davidson WR, Appel MJ, Doster GL et al. Diseases and parasites of red foxes, gray foxes, and coyotes from commercial sources selling to fox-chasing enclosures[J]. J WILDL Dis, 1992; 28(4): 581-589.
[2] Baumgartner W, Krakowka S, Blakeslee JR. Persistent infection of Vero cells by paramyxoviruses. A morphological and immunoelectron microscopic investigation[J]. Intervirology, 1987; 27(4): 218-223.
[3] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版. 北京：科学出版社出版， 1997：204-437.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-01-10, 百拇医药