梅毒螺旋体37000内鞭毛蛋白基因的扩增、克隆及鉴定
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37c医学网
作者：熊礼宽 周华 宁波
单位：熊礼宽 华(518020广东，深圳市慢性病防治院性病防治中心)；宁波(中山医科大学免疫教研室)
关键词：
中华皮肤科杂志000314
多数细菌的鞭毛是由单一多肽组成的多聚体，但与此相反，梅毒螺旋体(TP)的内鞭毛不在菌体表面，是由多肽排列于外鞘和中央核内，TP鞭毛的特殊解剖位置，使其不应是完整菌体最先识别的抗原，而事实则相反，鞭毛蛋白是人类感染TP后最先产生IgM和IgG抗体的抗原，可能是因其可借助于某种方式穿过外膜，暴露于菌体表面[1]。尽管该基因序列已清楚，但尚未在大肠杆菌中成功表达[2]。37000鞭毛蛋白抗原有很强的免疫原性，家兔感染1周内即可产生特异性抗体。因此，检测37000鞭毛蛋白抗体临床上可能颇有实用价值，但如何获得大量的抗原，首先必需成功克隆，然后进行高效表达。故我们用PCR扩增TP37000内鞭毛蛋白基因(FlaA)，进行克隆，现报道如下。
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一、材料和方法
(一)主要试剂：PCRMarker、λDNA/HinndⅢ+EcoRⅠ购自华美生物工程公司；溴化乙啶(EB)、溴酚蓝、十六烷基-三甲基溴化铵(CTAB)、氨苄西林购自Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)超纯、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K、溶菌酶购自Merck公司；琼脂糖、Taq酶、dNTP、质粒提取试剂盒购自Qiagene公司；限制性内切酶XmnⅠ、E.coliK12-TB1购自NewEnglandBioLab公司;限制性内切酶PstⅠ、T4DNALagase和琼脂糖酶购自GibcoBRL公司；ExpandTMHighFidelityPCRSystem购自BoehringerMannheim公司；低熔点琼脂糖、二甲苯青购自PharmaciaBiotech公司;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-gal)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、N，N-二甲基甲酰胺购自AmresCo公司;酵母提取物、胰蛋白胨、营养琼脂购自Oxoid公司;氯化钙购自和光纯药株式会社；其它试剂均为国产分析纯。
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(二)菌种和质粒：TP(Nichols)，全国性病麻风病控制中心龚匡隆惠赠；钩端螺旋体(Leptospira，LP)，中山医科大微生物教研室惠赠。pMAL-c2购自NewEnglandBioLab公司。
(三)TP和LPDNA提取：参照Isaacs等[3]介绍的方法。
(四)引物：根据Genebank发表的[2,3]TP37000内鞭毛蛋白FlaA基因序列，设计一对引物如下：P15′-CGTGGAAGGATTTCCGAAAGGAGCGTTTGA-3′，P25′-CCCTGCAGTACCCATCCGACCTC-3′，由上海生工有限公司合成。
(五)PCR扩增：P1和P2(1μg/μL)各5μL，2mmol/LdNTP5μL，10×PCR缓冲液5μL，TPDNA6μL，ExpandTMTaq酶2.5U，无菌无离子水24μL，混匀,快速离心后，加入30μL无菌石蜡油。同时设置一个LPDNA阴性对照和不加TPDNA模板的空白对照管。反应条件：94℃5min,94℃20s,53℃30s,72℃60s,10个循环后,从11个循环开始，每循环1周，延伸时间延长5s,至40个循环，最后72℃延伸10min。
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(六)PCR产物检测和纯化，FlaA基因和质粒pMAL-c2酶切，低熔点琼脂糖回收，连接，感受态细菌的制备，重组质粒转化感受态细菌，转化菌α-互补筛选：按《分子克隆实验指南》进行[4]。
(七)PCR鉴定重组pMAL-c2/FlaA质粒DNA：将2份重组质粒100℃煮沸10min后,取引物1和2各5μL，2mmol/LdNTP混合液2.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL,重组质粒3μL,无菌无离子水6.8μL,Taq酶(Qiagen)1.2U,液体石蜡2滴,快速离心混匀后，按下列条件扩增：94℃5min,94℃1min,55℃1min,72℃1.5min,35个循环,最后72℃延伸10min。电泳后观察结果。
(八)限制性酶切鉴定重组pMAL-c2/FlaA质粒DNA：按《分子克隆实验指南》进行[4]。
二、结果
, 百拇医药 (一)TP染色体DNA提取：将提取的TP染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察点样孔一边缘有一条清楚的带。
(二)PCR扩增目的基因：PCR产物电泳30min后,在302nm紫外灯下观察显示约1200bp处有一清晰整齐的条带，无拖尾、弥散(见图1)。
图1 0.9%凝胶电泳聚合酶链反应产物图
(三)PCR产物在pMAL-c2中定向克隆:连结混合物10μL转化感受态细胞，在涂有X-gal和IPTG的氨苄西林选择性SOB培养基中,培养8h,可见数个针尖样无色透明的小菌落，对照组(40ng质粒)可见数百个针尖样无色透明的小菌落,但培养至12h,实验组仅见2个中间为蓝色周围为白色的菌落,其它菌落为乳白色菌落，而对照组均为蓝色菌落。随后挑取2个白色菌落，分别接种于5mLLB液体培养基(含氨苄西林100μg/mL)中，37℃200r/min震摇培养4h,微量法快速提取质粒DNA,经0.9%琼脂糖凝胶电泳发现，重组质粒均在pMAL-c2空载体之后。将重组质粒命名为pMAL-FlaA。
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(四)pMAL-FlaA重组质粒PCR鉴定：经PCR后，电泳见到约1200bp插入片段(见图2)。
图2 0.9%凝胶电泳重组体pMAL-FlaAPCR产物图
(五)pMAL-FlaA重组质粒限制性酶切鉴定：经XmnⅠ和PstⅠ双酶切后，电泳见到约1200bp插入片段(见图3)。
图3 1.2%凝胶电泳酶切重组体pMAL-FlaAPCR图
三、讨论
所有的螺旋体都具有能动性(motility)，TP能侵入人体和在人体间传播主要由于其能动性。现研究表明，TP的内鞭毛为TP能动的细胞器，在梅毒的发病机理中起着十分重要的作用。迄今为止，人们已阐明了38种TP鞭毛相关性蛋白，根据其氨基酸N末端序列、基因序列和抗原相关性又将其分为A和B两类。TP37000为鞭毛A类，即FlaA；而结构和抗原性相关的FlaB1、FlaB2和FlaB3为B类。家兔感染TP7～10d后，其血清经免疫印迹技术分析表明，主要为内鞭毛蛋白抗体，Ⅰ期和Ⅱ期梅毒患者血清中也主要为37000抗体，因此，可检测TP37000抗体来诊断梅毒[1,5]。但如何获得大量的TP37000抗原，目前仍然是一个难题，因TP体外培养尚未成功，只能靠接种家兔睾丸进行活体培养，收集TP菌体，用去污剂除去TP外膜后，再经一系列分离纯化处理，方可获得极少量的TP内鞭毛蛋白，难以满足临床需要。Isaacs等[3]提取了TP染色体DNA，经DNase部分消化后进行琼脂糖凝胶电泳，构建一个λgt11噬菌体基因库，阐明了FlaA基因序列。
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FlaA基因从起始密码子到第156位碱基是编码成熟37000的信号肽序列，从第157位碱基到第1146位碱基是编码成熟37000序列。我们根据所要获取FlaA全基因序列，从第81位碱基扩增到第1269位碱基(共1189bp)。我们在两引物的5′端分别设计了限制性内切酶XmnⅠ和PstⅠ的酶切位点，以便于扩增的FlaA基因定向克隆于相应的酶切载体上。此外，在限制性内切酶XmnⅠ和PstⅠ的酶切位点分别引入了4和2个保护性碱基，以利于酶切反应。实际扩增的目的基因约1200bp。在进行双酶切载体pMAL-c2与目的基因FlaA时，本实验采用一步法酶切，在20μL的反应体积中，加入10×PstⅠ缓冲液和10×XmnⅡ缓冲液各1μL，限制性内切酶XmnⅡ和PstⅠ均可发挥高效酶切作用，简化了操作，减少两次酶切回收所造成载体pMAL-c2与目的基因FlaA的丢失。
广东省卫生科研基金资助(A1999556)；深圳市卫生科研基金资助(199806036)
参 考 文 献
, 百拇医药
1，熊礼宽，周华综述.梅毒螺旋体部分抗原分子生物学研究进展.国外医学传染病流行病学分册，1999,26:270-273.
2，Fraser CM,Norris SJ,Weinstock GM, et al.Complete genome sequence of Treponema pallidum,the syphilis spirochete. Science, 1998,281:375- 388.
3，Isaacs RD,Hanke JH, Guzman verduzco L, et al.Molecular cloning and DNA sequence analysis of the 37 kilodalton endoflagellar sheath protein gene of Treponema pallidum.Infect Immun,1989,57:3403- 3411.
4，Sambrook J,Fristsch EF,Maniatis T(金冬雁，黎孟风，张德政，等译).分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社出版，1998.16-60.
5，Norris SJ.Polypeptides of Treponema pallidum:Progress toward understarding their structuctural,functional,and immunologic roles. Microbiol Rev,1993,57:750- 779.
(收 稿 日 期 ： 1999- 08- 26), 百拇医药
单位：熊礼宽 华(518020广东，深圳市慢性病防治院性病防治中心)；宁波(中山医科大学免疫教研室)
关键词：
中华皮肤科杂志000314
多数细菌的鞭毛是由单一多肽组成的多聚体，但与此相反，梅毒螺旋体(TP)的内鞭毛不在菌体表面，是由多肽排列于外鞘和中央核内，TP鞭毛的特殊解剖位置，使其不应是完整菌体最先识别的抗原，而事实则相反，鞭毛蛋白是人类感染TP后最先产生IgM和IgG抗体的抗原，可能是因其可借助于某种方式穿过外膜，暴露于菌体表面[1]。尽管该基因序列已清楚，但尚未在大肠杆菌中成功表达[2]。37000鞭毛蛋白抗原有很强的免疫原性，家兔感染1周内即可产生特异性抗体。因此，检测37000鞭毛蛋白抗体临床上可能颇有实用价值，但如何获得大量的抗原，首先必需成功克隆，然后进行高效表达。故我们用PCR扩增TP37000内鞭毛蛋白基因(FlaA)，进行克隆，现报道如下。
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一、材料和方法
(一)主要试剂：PCRMarker、λDNA/HinndⅢ+EcoRⅠ购自华美生物工程公司；溴化乙啶(EB)、溴酚蓝、十六烷基-三甲基溴化铵(CTAB)、氨苄西林购自Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)超纯、十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K、溶菌酶购自Merck公司；琼脂糖、Taq酶、dNTP、质粒提取试剂盒购自Qiagene公司；限制性内切酶XmnⅠ、E.coliK12-TB1购自NewEnglandBioLab公司;限制性内切酶PstⅠ、T4DNALagase和琼脂糖酶购自GibcoBRL公司；ExpandTMHighFidelityPCRSystem购自BoehringerMannheim公司；低熔点琼脂糖、二甲苯青购自PharmaciaBiotech公司;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-gal)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、N，N-二甲基甲酰胺购自AmresCo公司;酵母提取物、胰蛋白胨、营养琼脂购自Oxoid公司;氯化钙购自和光纯药株式会社；其它试剂均为国产分析纯。
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(二)菌种和质粒：TP(Nichols)，全国性病麻风病控制中心龚匡隆惠赠；钩端螺旋体(Leptospira，LP)，中山医科大微生物教研室惠赠。pMAL-c2购自NewEnglandBioLab公司。
(三)TP和LPDNA提取：参照Isaacs等[3]介绍的方法。
(四)引物：根据Genebank发表的[2,3]TP37000内鞭毛蛋白FlaA基因序列，设计一对引物如下：P15′-CGTGGAAGGATTTCCGAAAGGAGCGTTTGA-3′，P25′-CCCTGCAGTACCCATCCGACCTC-3′，由上海生工有限公司合成。
(五)PCR扩增：P1和P2(1μg/μL)各5μL，2mmol/LdNTP5μL，10×PCR缓冲液5μL，TPDNA6μL，ExpandTMTaq酶2.5U，无菌无离子水24μL，混匀,快速离心后，加入30μL无菌石蜡油。同时设置一个LPDNA阴性对照和不加TPDNA模板的空白对照管。反应条件：94℃5min,94℃20s,53℃30s,72℃60s,10个循环后,从11个循环开始，每循环1周，延伸时间延长5s,至40个循环，最后72℃延伸10min。
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(六)PCR产物检测和纯化，FlaA基因和质粒pMAL-c2酶切，低熔点琼脂糖回收，连接，感受态细菌的制备，重组质粒转化感受态细菌，转化菌α-互补筛选：按《分子克隆实验指南》进行[4]。
(七)PCR鉴定重组pMAL-c2/FlaA质粒DNA：将2份重组质粒100℃煮沸10min后,取引物1和2各5μL，2mmol/LdNTP混合液2.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL,重组质粒3μL,无菌无离子水6.8μL,Taq酶(Qiagen)1.2U,液体石蜡2滴,快速离心混匀后，按下列条件扩增：94℃5min,94℃1min,55℃1min,72℃1.5min,35个循环,最后72℃延伸10min。电泳后观察结果。
(八)限制性酶切鉴定重组pMAL-c2/FlaA质粒DNA：按《分子克隆实验指南》进行[4]。
二、结果
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(二)PCR扩增目的基因：PCR产物电泳30min后,在302nm紫外灯下观察显示约1200bp处有一清晰整齐的条带，无拖尾、弥散(见图1)。
图1 0.9%凝胶电泳聚合酶链反应产物图
(三)PCR产物在pMAL-c2中定向克隆:连结混合物10μL转化感受态细胞，在涂有X-gal和IPTG的氨苄西林选择性SOB培养基中,培养8h,可见数个针尖样无色透明的小菌落，对照组(40ng质粒)可见数百个针尖样无色透明的小菌落,但培养至12h,实验组仅见2个中间为蓝色周围为白色的菌落,其它菌落为乳白色菌落，而对照组均为蓝色菌落。随后挑取2个白色菌落，分别接种于5mLLB液体培养基(含氨苄西林100μg/mL)中，37℃200r/min震摇培养4h,微量法快速提取质粒DNA,经0.9%琼脂糖凝胶电泳发现，重组质粒均在pMAL-c2空载体之后。将重组质粒命名为pMAL-FlaA。
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(四)pMAL-FlaA重组质粒PCR鉴定：经PCR后，电泳见到约1200bp插入片段(见图2)。
图2 0.9%凝胶电泳重组体pMAL-FlaAPCR产物图
(五)pMAL-FlaA重组质粒限制性酶切鉴定：经XmnⅠ和PstⅠ双酶切后，电泳见到约1200bp插入片段(见图3)。
图3 1.2%凝胶电泳酶切重组体pMAL-FlaAPCR图
三、讨论
所有的螺旋体都具有能动性(motility)，TP能侵入人体和在人体间传播主要由于其能动性。现研究表明，TP的内鞭毛为TP能动的细胞器，在梅毒的发病机理中起着十分重要的作用。迄今为止，人们已阐明了38种TP鞭毛相关性蛋白，根据其氨基酸N末端序列、基因序列和抗原相关性又将其分为A和B两类。TP37000为鞭毛A类，即FlaA；而结构和抗原性相关的FlaB1、FlaB2和FlaB3为B类。家兔感染TP7～10d后，其血清经免疫印迹技术分析表明，主要为内鞭毛蛋白抗体，Ⅰ期和Ⅱ期梅毒患者血清中也主要为37000抗体，因此，可检测TP37000抗体来诊断梅毒[1,5]。但如何获得大量的TP37000抗原，目前仍然是一个难题，因TP体外培养尚未成功，只能靠接种家兔睾丸进行活体培养，收集TP菌体，用去污剂除去TP外膜后，再经一系列分离纯化处理，方可获得极少量的TP内鞭毛蛋白，难以满足临床需要。Isaacs等[3]提取了TP染色体DNA，经DNase部分消化后进行琼脂糖凝胶电泳，构建一个λgt11噬菌体基因库，阐明了FlaA基因序列。
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FlaA基因从起始密码子到第156位碱基是编码成熟37000的信号肽序列，从第157位碱基到第1146位碱基是编码成熟37000序列。我们根据所要获取FlaA全基因序列，从第81位碱基扩增到第1269位碱基(共1189bp)。我们在两引物的5′端分别设计了限制性内切酶XmnⅠ和PstⅠ的酶切位点，以便于扩增的FlaA基因定向克隆于相应的酶切载体上。此外，在限制性内切酶XmnⅠ和PstⅠ的酶切位点分别引入了4和2个保护性碱基，以利于酶切反应。实际扩增的目的基因约1200bp。在进行双酶切载体pMAL-c2与目的基因FlaA时，本实验采用一步法酶切，在20μL的反应体积中，加入10×PstⅠ缓冲液和10×XmnⅡ缓冲液各1μL，限制性内切酶XmnⅡ和PstⅠ均可发挥高效酶切作用，简化了操作，减少两次酶切回收所造成载体pMAL-c2与目的基因FlaA的丢失。
广东省卫生科研基金资助(A1999556)；深圳市卫生科研基金资助(199806036)
参 考 文 献
, 百拇医药
1，熊礼宽，周华综述.梅毒螺旋体部分抗原分子生物学研究进展.国外医学传染病流行病学分册，1999,26:270-273.
2，Fraser CM,Norris SJ,Weinstock GM, et al.Complete genome sequence of Treponema pallidum,the syphilis spirochete. Science, 1998,281:375- 388.
3，Isaacs RD,Hanke JH, Guzman verduzco L, et al.Molecular cloning and DNA sequence analysis of the 37 kilodalton endoflagellar sheath protein gene of Treponema pallidum.Infect Immun,1989,57:3403- 3411.
4，Sambrook J,Fristsch EF,Maniatis T(金冬雁，黎孟风，张德政，等译).分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社出版，1998.16-60.
5，Norris SJ.Polypeptides of Treponema pallidum:Progress toward understarding their structuctural,functional,and immunologic roles. Microbiol Rev,1993,57:750- 779.
(收 稿 日 期 ： 1999- 08- 26), 百拇医药