同一卵泡内两个卵母细胞一例
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作者：孔令红 刘忠 邢福祺
单位：
关键词：
中华妇产科杂志000302【摘要】 目的 对正常妊娠妇女及妊娠高血压综合征(妊高征)患者血管紧张素Ⅱ 1 型受体(AT1R)基因A1166位点的多态性进行分析，探讨AT1R基因A1166位点的多态性与妊高征发病的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)、限制性酶切及电泳分型等方法,对正常妊娠妇女、妊高征患者及原发性高血压患者(女性)AT 1R基因A1166位点的多态性进行分析。结果 (1)正常妊娠妇女、妊高征患者及原发性高血压患者中AT 1R基因A1166位点的基因型频率，符合Hardy-Weinberg平衡定律。(2)正常妊娠妇女，妊高征患者及原发性高血压患者中，AT 1R基因A1166位点C基因频率分别为3.7%，11.4%及9.4%。(3)妊高征患者中A1166→C变异体(AC，CC)出现率为20.5%，明显高于正常妊娠妇女的7.4%。(4)原发性高血压患者AT 1R基因A1166位点的变异基因型(AC，CC)，和C等位基因的频率分别为18.8%及9.4%，明显高于正常妊娠妇女；妊高征患者与原发性高血压患者的多态位点A1166→C基因型间差异无显著性(P>0.05)。结论 (1)AT 1R基因A1166位点的变异(A→C)的出现，可能增大了患妊高征的风险，并与妊高征发病有关。(2)妊高征患者可能携带了患原发性高血压的危险因素。两者在分子遗传学方面有一定的内在联系。
, 百拇医药
The Association between A1166→C of Angiotensin Ⅱ type 1 Receptor Gene and Pregnancy Induced Hypertension
HU Yuhong*, BI Yuntian, GUAN Guizhen, et al.
* Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Medical College of Jiamusi University， Jiamusi 154003, China
【Abstract】 Objective To determine the distribution of gene type of A1166 polymorphism site of the angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene(AT1RG) and whether it might be implicated in pregnancy induced hypertension (PIH) woman. Methods We used polymerase chain reaction (PCR), restriction enzyme analysis and electrophoresis for this study. Results 1. The gene types of A1166 polymorphism site of AT1R gene on normal control and PIH and essential hypertension subjects were in accordance with Hardy-Weinberg laws. 2.The C allele frequencies of AT1R gene (A1166→C) in control, PIH, and essential hypertension subjects was 3.7%, 11.4%, and 9.4%, respectively. 3. The frequency of variants(AC,CC) of AT1R gene A1166 polymorphism site in PIH (20.5%) was significantly higher than that of control subjects (7.4%). 4. The gene type of variants (AC,CC) and C allele frequency of AT1R gene A1166 polymorphism site in essential hypertension (18.8%, 9.4%, respectively) was higher than those of control subjects. There is no statistical difference in A1166→C variants between PIH and essential hypertension. Conclusions 1.The variants(A→C) of 1166 polymorphsim site of AT1RG predisposes increased risk of PIH. 2.The PIH patients are at the risk of suffering from essential hypertension.
, 百拇医药
【Key words】 Pregnancy complications, cardiovascular；Hypertension; Angiotensin Ⅱ; Receptors, angiolensin； Polymorphism (genetics)
妊娠高血压综合征(妊高征)是导致孕产妇及围产儿死亡的主要疾病之一。妊高征的病因不十分清楚，但从临床角度观察及国内外大量资料证明妊高征有明显的遗传倾向[1]，妊高征主要表现为血压的升高及机体代谢紊乱。肾素-血管紧张素系统在维持机体水盐平衡和调节心血管活动中起着十分重要的作用，尤其是血管紧张素Ⅱ的作用最强，而血管紧张素Ⅱ又必须通过血管紧张素Ⅱ受体，主要是血管紧张素Ⅱ1型受体(AT 1R)发挥作用，这一受体的分子生物学改变可能将影响其功能的变化。我们采用聚合酶链反应(PCR)技术，限制性酶切及电泳分型等方法，探讨正常妊娠妇女及妊高征妇女群体中AT 1R基因A1166→C多态位点变异的分布，为妊高征的遗传病因学提供依据。
, 百拇医药
资料和方法
一、 资料来源
选择1996年至1998年佳木斯大学临床医学院第一附属医院妇产科，佳木斯市妇幼保健院产科及佳木斯市中心医院产科、内科住院患者，所有患者均未经治疗。分组为： (1)正常妊娠组：正常妊娠妇女136例，妊娠32～41周，年龄20～39岁,身体健康。(2)妊高征组：妊高征患者88例，按国际通用标准诊断，妊娠31～40周，年龄21～37岁，且不合并有其他可引起血压升高的内科疾患。(3)原发性高血压组：原发性高血压患者(女性)80例，25～58岁。
二、方法
1.人基因组DNA的提取：用饱和盐析法[2，3]。
2.PCR扩增AT1R基因片段： 运用DNA扩增仪扩增AT1R基因A1166目的片段[4]，其反应体系为引物各为0.25 μl，缓冲液2.5 μl，脱氧三核苷酸1.0 μl，TaqDNA聚合酶0.125 μl，MgCl2 1.5 μl，ddH2O18.875 μl，DNA模板0.5 μl ，使单管反应体积至25 μl。反应参数为模板变性95℃ 300 s，循环变性92℃ 50 s，循环退火55℃ 40 s，循环延伸72℃ 90 s，循环30周后72℃延伸300 s。
, 百拇医药
3.PCR产物检测： 上述PCR扩增的DNA片段采用7%聚丙烯酰胺凝胶电泳检查。记录并将出现特异条带的AT1R基因特异扩增产物置冰箱保存以备酶切[5]。
4.限制性内切酶切割： 酶切反应体系PCR产物7.0 μl，ddH2O 10.8 μl，缓冲液2.0 μl，DdeI 0.2 μl，使单管反应体积至20 μl。按上述顺序将各种反应物加入离心管，混匀后置60℃水浴箱中孵育3 h，取出置冰箱4℃保存。
5.电泳分型： 采用7%聚丙烯酰胺凝胶，φX174/HaeⅢ标记，紫外检测仪下观察、分型、拍照并记录。
三、统计学方法
统计结果运用χ2检验。
结果
, 百拇医药
一、 AT1R基因A1166→C多态性电泳分型图谱
AT 1R基因A1166位点的PCR扩增产物为274bp。经限制性内切酶DdeI切割，产生两个片段，159bp和115bp,即为CC型(1166C/1166C)；产生3个片段274bp, 159bp和115bp，即AC型(1166A/1166C)；仅产生1个片段274bp,即AA型(1166A/1166A)。见图1。
1：Marker DNA 2、4、5：AC型 3：CC型 7、8、10、11：AA型
图1 AT 1R基因A1166→C多态性的电泳分型图谱
, 百拇医药
二、AT 1R基因A1166→C在正常妊娠妇女、妊高征妇女及原发性高血压患者中的分布
3组妇女AT 1R基因A1166→C多态性划分结果显示，(1) 正常妊娠妇女基因型为AA126例，AC 10例和CC 0例，A和C的基因频率分别为96.3%和3.7%。(2) 妊高征妇女的基因型为AA 70例，AC 16例，CC 2例，A和C基因频率分别为88.6%和11.4%。 (3) 原发性高血压患者基因型AA 65例，AC 15例及CC 0例，A和C的基因频率分别为90.6%和9.4%。经Hardy-Weinberg平衡定律检验，AT 1R基因A1166位点的基因型分布显示，正常妊娠妇女、妊高征及原发性高血压患者处于遗传平衡状态。
三、3组妇女AT 1R基因A1166→C多态性比较
妊高征组A基因频率为88.6%，明显低于正常妊娠组的 96.3%,而妊高征组C基因的频率为11.4%，明显高于正常妊娠组的3.7%，等位基因C的出现率明显高于正常妊娠组(χ2=14.81，P<0.01)。正常妊娠组无CC纯合子，而妊高征组却发现A1166位点基因变异的纯合子。妊高征组AT 1R基因变异位点A1166变异的基因型(AC，CC)频率明显增高，与正常妊娠组相比差异有显著性(χ2=8.835，P<0.01)。 原发性高血压组变异体AC明显高于正常妊娠组(χ2=6.39，P<0.05)，妊高征组与原发性高血压组C基因频率均高于正常妊娠组，妊高征组C基因频率，略高于原发性高血压组，妊高征组与原发性高血压组AT 1R基因A1166位点的变异基因型之间差异无显著性(χ2=0.77，P>0.05)。见表1。
, 百拇医药
表1 3组妇女AT 1R基因A1166→C变异位点
基因型频率及基因频率的比较 组别
例数
基因型频率
基因频率
AA
AC
CC
A
(%)
C
(%)
, 百拇医药
例数
百分率
(%)
例数
百分率
(%)
例数
百分率
(%)
正常妊娠
组
136
126
, 百拇医药 92.6
10
7.4
0
0.0
96.3
3.7
妊高征组
88
70
79.5
16
18.2
, 百拇医药 2
2.3
88.6
11.4
原发性高 血压组
80
65
81.2
15
18.8
0
0.0
90.6
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9.4
讨论
AT1R主要分布在血管平滑肌细胞，它介导血管紧张素Ⅱ的生理功能，即维持机体代谢平衡及保持血管张力。AT 1R基因含359个氨基酸，属于G蛋白家族成员，并与牛、大鼠的氨基酸顺序高度一致。它有7个跨膜区域，位于染色体3q21～q25[6],它的编码区只有1个外显子，没有内含子，存在1个开放读码框，全长1080 bp。
Bonnardeaux等[7]运用PCR扩增了60例具有家族易感性高血压患者的AT 1R基因全部编码区和3′非翻译区，并结合单链构象多态检测到了5个多态位点(T537→C、A1062→G、A1166→C、G1517→T和A1878→G)，只有3′区1166多态位点的C等位基因频率在高血压家族史的患者中有明显升高。这从而提示AT 1R基因A1166多态位点的等位基因的频率与原发性高血压呈显著相关。
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从我们的研究结果可以看出,AT1R基因第A1166位点核苷酸的变异与妊高征呈显著相关。妊高征患者AT 1R基因A1166位点的多态变异等位基因C频率明显增加，基因型AC、CC频率明显高于正常妊娠组。说明AT 1R基因A1166位点的多态性与妊高征发病有关，这一位点的变异(A→C)可能增大了患妊高征的风险。
妊高征与原发性高血压均是以血压升高为主，同时伴各脏器功能障碍的疾病，而妊高征是妊娠期特有的疾病。妊高征与原发性高血压AT 1R基因A1166多态位点C基因频率均高于正常妊娠组，二者变异基因型之间差异不显著,但均与正常妊娠组存在着显著差异，即妊高征与原发性高血压AT 1R基因A1166位点等位基因相似，这提示妊高征妇女可能携带了今后生活中发生原发性高血压的危险基因，即妊高征妇女的基因型特点决定了她在今后的生活中易发生原发性高血压。这说明妊高征与原发性高血压在分子遗传学方面有一定的内在联系，这为妊高征的预后及原发性高血压的风险预测提供了一定的理论依据。
, 百拇医药
参考文献
1，Cooper DW,Liston WA.Genetic control of severe pre-eclampsia.J Med Genetics,1979,16:409-416.
2，Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. 分子克隆实验指南. 金冬雁,黎孟凤， 译. 第2版. 北京： 科学出版社，1993. 464.
3，Cavenee W,Leach R,Mohandas J.Isolation and regional localization of DNA segments revealing polymorphic loci from human chromsome 13.Am J Hum Genet, 1984,36:10-24.
4，林万明. PCR技术操作和应用指南. 北京.人民军医出版社,1993. 61-62.
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5，Caulfield M,MRCD,Lavender P,et al.Linkage of the angiotensinogen gene to essential hypertension.N Engl J Med,1994,Jun 9:1629-1633.
6，Hiroaki F,Guo DF,Inagami T,et al.Molecular cloing and sequencing of the gene encoding human angiotensin Ⅱ type 1 receptor.Biochemi Bioph Res Commu,1992,183:8-13.
7，Bonnardeaux A,Davies E, Jeunemaitre X, et al. Angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene polymorphism in human essential hypertension. Hypertension, 1994,24 :61-69.
(收稿日期：1999-07-09), 百拇医药
单位：
关键词：
中华妇产科杂志000302【摘要】 目的 对正常妊娠妇女及妊娠高血压综合征(妊高征)患者血管紧张素Ⅱ 1 型受体(AT1R)基因A1166位点的多态性进行分析，探讨AT1R基因A1166位点的多态性与妊高征发病的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)、限制性酶切及电泳分型等方法,对正常妊娠妇女、妊高征患者及原发性高血压患者(女性)AT 1R基因A1166位点的多态性进行分析。结果 (1)正常妊娠妇女、妊高征患者及原发性高血压患者中AT 1R基因A1166位点的基因型频率，符合Hardy-Weinberg平衡定律。(2)正常妊娠妇女，妊高征患者及原发性高血压患者中，AT 1R基因A1166位点C基因频率分别为3.7%，11.4%及9.4%。(3)妊高征患者中A1166→C变异体(AC，CC)出现率为20.5%，明显高于正常妊娠妇女的7.4%。(4)原发性高血压患者AT 1R基因A1166位点的变异基因型(AC，CC)，和C等位基因的频率分别为18.8%及9.4%，明显高于正常妊娠妇女；妊高征患者与原发性高血压患者的多态位点A1166→C基因型间差异无显著性(P>0.05)。结论 (1)AT 1R基因A1166位点的变异(A→C)的出现，可能增大了患妊高征的风险，并与妊高征发病有关。(2)妊高征患者可能携带了患原发性高血压的危险因素。两者在分子遗传学方面有一定的内在联系。
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The Association between A1166→C of Angiotensin Ⅱ type 1 Receptor Gene and Pregnancy Induced Hypertension
HU Yuhong*, BI Yuntian, GUAN Guizhen, et al.
* Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Medical College of Jiamusi University， Jiamusi 154003, China
【Abstract】 Objective To determine the distribution of gene type of A1166 polymorphism site of the angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene(AT1RG) and whether it might be implicated in pregnancy induced hypertension (PIH) woman. Methods We used polymerase chain reaction (PCR), restriction enzyme analysis and electrophoresis for this study. Results 1. The gene types of A1166 polymorphism site of AT1R gene on normal control and PIH and essential hypertension subjects were in accordance with Hardy-Weinberg laws. 2.The C allele frequencies of AT1R gene (A1166→C) in control, PIH, and essential hypertension subjects was 3.7%, 11.4%, and 9.4%, respectively. 3. The frequency of variants(AC,CC) of AT1R gene A1166 polymorphism site in PIH (20.5%) was significantly higher than that of control subjects (7.4%). 4. The gene type of variants (AC,CC) and C allele frequency of AT1R gene A1166 polymorphism site in essential hypertension (18.8%, 9.4%, respectively) was higher than those of control subjects. There is no statistical difference in A1166→C variants between PIH and essential hypertension. Conclusions 1.The variants(A→C) of 1166 polymorphsim site of AT1RG predisposes increased risk of PIH. 2.The PIH patients are at the risk of suffering from essential hypertension.
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【Key words】 Pregnancy complications, cardiovascular；Hypertension; Angiotensin Ⅱ; Receptors, angiolensin； Polymorphism (genetics)
妊娠高血压综合征(妊高征)是导致孕产妇及围产儿死亡的主要疾病之一。妊高征的病因不十分清楚，但从临床角度观察及国内外大量资料证明妊高征有明显的遗传倾向[1]，妊高征主要表现为血压的升高及机体代谢紊乱。肾素-血管紧张素系统在维持机体水盐平衡和调节心血管活动中起着十分重要的作用，尤其是血管紧张素Ⅱ的作用最强，而血管紧张素Ⅱ又必须通过血管紧张素Ⅱ受体，主要是血管紧张素Ⅱ1型受体(AT 1R)发挥作用，这一受体的分子生物学改变可能将影响其功能的变化。我们采用聚合酶链反应(PCR)技术，限制性酶切及电泳分型等方法，探讨正常妊娠妇女及妊高征妇女群体中AT 1R基因A1166→C多态位点变异的分布，为妊高征的遗传病因学提供依据。
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资料和方法
一、 资料来源
选择1996年至1998年佳木斯大学临床医学院第一附属医院妇产科，佳木斯市妇幼保健院产科及佳木斯市中心医院产科、内科住院患者，所有患者均未经治疗。分组为： (1)正常妊娠组：正常妊娠妇女136例，妊娠32～41周，年龄20～39岁,身体健康。(2)妊高征组：妊高征患者88例，按国际通用标准诊断，妊娠31～40周，年龄21～37岁，且不合并有其他可引起血压升高的内科疾患。(3)原发性高血压组：原发性高血压患者(女性)80例，25～58岁。
二、方法
1.人基因组DNA的提取：用饱和盐析法[2，3]。
2.PCR扩增AT1R基因片段： 运用DNA扩增仪扩增AT1R基因A1166目的片段[4]，其反应体系为引物各为0.25 μl，缓冲液2.5 μl，脱氧三核苷酸1.0 μl，TaqDNA聚合酶0.125 μl，MgCl2 1.5 μl，ddH2O18.875 μl，DNA模板0.5 μl ，使单管反应体积至25 μl。反应参数为模板变性95℃ 300 s，循环变性92℃ 50 s，循环退火55℃ 40 s，循环延伸72℃ 90 s，循环30周后72℃延伸300 s。
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3.PCR产物检测： 上述PCR扩增的DNA片段采用7%聚丙烯酰胺凝胶电泳检查。记录并将出现特异条带的AT1R基因特异扩增产物置冰箱保存以备酶切[5]。
4.限制性内切酶切割： 酶切反应体系PCR产物7.0 μl，ddH2O 10.8 μl，缓冲液2.0 μl，DdeI 0.2 μl，使单管反应体积至20 μl。按上述顺序将各种反应物加入离心管，混匀后置60℃水浴箱中孵育3 h，取出置冰箱4℃保存。
5.电泳分型： 采用7%聚丙烯酰胺凝胶，φX174/HaeⅢ标记，紫外检测仪下观察、分型、拍照并记录。
三、统计学方法
统计结果运用χ2检验。
结果
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一、 AT1R基因A1166→C多态性电泳分型图谱
AT 1R基因A1166位点的PCR扩增产物为274bp。经限制性内切酶DdeI切割，产生两个片段，159bp和115bp,即为CC型(1166C/1166C)；产生3个片段274bp, 159bp和115bp，即AC型(1166A/1166C)；仅产生1个片段274bp,即AA型(1166A/1166A)。见图1。
1：Marker DNA 2、4、5：AC型 3：CC型 7、8、10、11：AA型
图1 AT 1R基因A1166→C多态性的电泳分型图谱
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二、AT 1R基因A1166→C在正常妊娠妇女、妊高征妇女及原发性高血压患者中的分布
3组妇女AT 1R基因A1166→C多态性划分结果显示，(1) 正常妊娠妇女基因型为AA126例，AC 10例和CC 0例，A和C的基因频率分别为96.3%和3.7%。(2) 妊高征妇女的基因型为AA 70例，AC 16例，CC 2例，A和C基因频率分别为88.6%和11.4%。 (3) 原发性高血压患者基因型AA 65例，AC 15例及CC 0例，A和C的基因频率分别为90.6%和9.4%。经Hardy-Weinberg平衡定律检验，AT 1R基因A1166位点的基因型分布显示，正常妊娠妇女、妊高征及原发性高血压患者处于遗传平衡状态。
三、3组妇女AT 1R基因A1166→C多态性比较
妊高征组A基因频率为88.6%，明显低于正常妊娠组的 96.3%,而妊高征组C基因的频率为11.4%，明显高于正常妊娠组的3.7%，等位基因C的出现率明显高于正常妊娠组(χ2=14.81，P<0.01)。正常妊娠组无CC纯合子，而妊高征组却发现A1166位点基因变异的纯合子。妊高征组AT 1R基因变异位点A1166变异的基因型(AC，CC)频率明显增高，与正常妊娠组相比差异有显著性(χ2=8.835，P<0.01)。 原发性高血压组变异体AC明显高于正常妊娠组(χ2=6.39，P<0.05)，妊高征组与原发性高血压组C基因频率均高于正常妊娠组，妊高征组C基因频率，略高于原发性高血压组，妊高征组与原发性高血压组AT 1R基因A1166位点的变异基因型之间差异无显著性(χ2=0.77，P>0.05)。见表1。
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表1 3组妇女AT 1R基因A1166→C变异位点
基因型频率及基因频率的比较 组别
例数
基因型频率
基因频率
AA
AC
CC
A
(%)
C
(%)
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例数
百分率
(%)
例数
百分率
(%)
例数
百分率
(%)
正常妊娠
组
136
126
, 百拇医药 92.6
10
7.4
0
0.0
96.3
3.7
妊高征组
88
70
79.5
16
18.2
, 百拇医药 2
2.3
88.6
11.4
原发性高 血压组
80
65
81.2
15
18.8
0
0.0
90.6
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9.4
讨论
AT1R主要分布在血管平滑肌细胞，它介导血管紧张素Ⅱ的生理功能，即维持机体代谢平衡及保持血管张力。AT 1R基因含359个氨基酸，属于G蛋白家族成员，并与牛、大鼠的氨基酸顺序高度一致。它有7个跨膜区域，位于染色体3q21～q25[6],它的编码区只有1个外显子，没有内含子，存在1个开放读码框，全长1080 bp。
Bonnardeaux等[7]运用PCR扩增了60例具有家族易感性高血压患者的AT 1R基因全部编码区和3′非翻译区，并结合单链构象多态检测到了5个多态位点(T537→C、A1062→G、A1166→C、G1517→T和A1878→G)，只有3′区1166多态位点的C等位基因频率在高血压家族史的患者中有明显升高。这从而提示AT 1R基因A1166多态位点的等位基因的频率与原发性高血压呈显著相关。
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从我们的研究结果可以看出,AT1R基因第A1166位点核苷酸的变异与妊高征呈显著相关。妊高征患者AT 1R基因A1166位点的多态变异等位基因C频率明显增加，基因型AC、CC频率明显高于正常妊娠组。说明AT 1R基因A1166位点的多态性与妊高征发病有关，这一位点的变异(A→C)可能增大了患妊高征的风险。
妊高征与原发性高血压均是以血压升高为主，同时伴各脏器功能障碍的疾病，而妊高征是妊娠期特有的疾病。妊高征与原发性高血压AT 1R基因A1166多态位点C基因频率均高于正常妊娠组，二者变异基因型之间差异不显著,但均与正常妊娠组存在着显著差异，即妊高征与原发性高血压AT 1R基因A1166位点等位基因相似，这提示妊高征妇女可能携带了今后生活中发生原发性高血压的危险基因，即妊高征妇女的基因型特点决定了她在今后的生活中易发生原发性高血压。这说明妊高征与原发性高血压在分子遗传学方面有一定的内在联系，这为妊高征的预后及原发性高血压的风险预测提供了一定的理论依据。
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参考文献
1，Cooper DW,Liston WA.Genetic control of severe pre-eclampsia.J Med Genetics,1979,16:409-416.
2，Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. 分子克隆实验指南. 金冬雁,黎孟凤， 译. 第2版. 北京： 科学出版社，1993. 464.
3，Cavenee W,Leach R,Mohandas J.Isolation and regional localization of DNA segments revealing polymorphic loci from human chromsome 13.Am J Hum Genet, 1984,36:10-24.
4，林万明. PCR技术操作和应用指南. 北京.人民军医出版社,1993. 61-62.
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5，Caulfield M,MRCD,Lavender P,et al.Linkage of the angiotensinogen gene to essential hypertension.N Engl J Med,1994,Jun 9:1629-1633.
6，Hiroaki F,Guo DF,Inagami T,et al.Molecular cloing and sequencing of the gene encoding human angiotensin Ⅱ type 1 receptor.Biochemi Bioph Res Commu,1992,183:8-13.
7，Bonnardeaux A,Davies E, Jeunemaitre X, et al. Angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene polymorphism in human essential hypertension. Hypertension, 1994,24 :61-69.
(收稿日期：1999-07-09), 百拇医药