雌三醇及三苯氧胺对人结肠癌细胞内游离钙离子浓度的影响
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作者：黄兴兰 吴浩 陈斌 张正
单位：黄兴兰(华西医科大学附属第一医院消化内科(成都 610041)； 吴浩(华西医科大学附属第一医院消化内科(成都 610041)； 陈斌(华西医科大学附属第一医院消化内科(成都 610041)； 张正(华西医科大学附属第一医院消化内科(成都 610041)
关键词：雌三醇；三苯氧胺；结肠癌；胞内游离钙离子
华西医学000173 摘 要：目的：探讨雌三醇(E3)及三苯氧胺(TAM)对人结肠癌细胞内游离钙离子([Ca2+]i)水平的影响及其意义。方法：采用流式细胞仪动态检测E3及TAM作用后，人结肠癌细胞内[Ca2+]i水平的变化。结果：①E3使细胞内[Ca2+]i水平下降，并维持在一个较低水平(27.88nM)，与静息状态细胞内[Ca2+]i水平(94.40nM)相比有显著性差异(P<0.05)。②TAM使细胞内[Ca2+]i水平上升，并维持在一个较高水平(349.97nM)，与静息状态细胞内[Ca2+]i水平(107.88nM)相比有显著性差异(P<0.05)。结论：①E3不引起胞内[Ca2+]i水平升高，E3促人结肠癌细胞增殖作用的机理符合甾体激素的基因调节作用，未见与钙离子通道的非基因的快速调节作用有关。②TAM抑制人结肠癌细胞增殖的机理，除通过竞争性结合雌激素受体外，还可能通过了改变胞内[Ca2+]i浓度等途径。
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分类号：R735.3+6；R458+7 文献标识码：A
文章编号：1002-0179(2000)01-0100-02
Effect of Estriol and Tamoxifen on the Concentration of Intracellular Free Calcium in Human Colonic Cancer Cells
HUANG Xing-lan WU Hao CHEN Bin
(Department of Gastroenterology，The First University Hospital，West China University of Medical Science，Chengdu 610041.)
, 百拇医药
Abstract：Object：To study the effect of estriol(E3)and tamoxifen (TAM)on the concentration of intracellular free，calcium in human colonic cancer cells and analyses the significance of the effect.Methods：Flow cytometry was used to continuously monitor the change of the intracellular free calcium([Ca2+]i) in human colonic cancer cells(HT-29 cells )treated with E3 and TAM.Results：First，E3 made the intracellular [Ca2+]i concentrations maintained a lower level (27.88nM)and was much lower than that of the intracellular [Ca2+]i of static status cells(94.4nM).There was statistically difference between 27.88nM and 94.4nM(P<0.05).Secondly，TAM made the intracellular [Ca2+]i level increase.Then the intracellular [Ca2+]i level maintained a higher level (349.97nM)and was much higher than that of the intracellular[Ca2+]i of static status cells(107.88nM).There was statistically difference between 349.97 nM and 107.88nM(P<0.05).Conclusion：① E3 can not cause the intracellular [Ca2+]i increase.The effect mechanism of E3 due to the effect of gene regulation，but not the effect of rapid non-gene regulation by Ca2+ cannel.② TAM can inhibit the proliferation of cancer cells by changing the intracellular [Ca2+]i of concentration and competitively combine the estrogen receptor.
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Key words：Estriol；Tamoxifen；Colonic cancer；Intracellular free calcium.▲
雌激素受体(ER)可存在于部分胃肠道等非性激素靶器官肿瘤细胞中，这些受体具有生物活性[1]，雌激素可刺激ER阳性的肿瘤细胞生长，而雌激素受体拮抗剂三苯氧胺可抑制肿瘤的生长，其作用可能与胞内钙通道有关。本实验用E3及TAM作用于HT-29人结肠癌细胞株，用流式细胞仪动态监测细胞内[Ca2+]i水平，以探讨E3及TAM的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料 HT-29人结肠癌细胞系从湖南医科大学肿瘤研究所引种，由我院内科实验室传代培养；TAM购自上海华联制药有限公司；E3购自上海制药十二厂；fluor-3/Am购自Sigma公司；流式细胞仪系美国COULER公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 E3先用乙醇溶解(乙醇终浓度<0.1%>)，然后用PBS液稀释至工作浓度；TAM用PBS液溶解、过滤、稀释至工作浓度；小牛血清用活性碳10g/L、葡聚糖T 70lg/L，50℃搅拌30分钟，以清除游离雌激素。
1.2.2 流式细胞仪测细胞内[Ca2+]i浓度：①细胞悬液的制备：HT-29细胞在含10%小牛血清1640培养液中培养72小时，实验前换为无血清1640培养液继续培养24小时，用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化后制成单细胞悬液，细胞浓度为107个/ml左右。②荧光剂负载：在制备好的细胞悬液中加入flour-3/Am，以10μM浓度，37℃孵育20分钟后，用1640培养液稀释5倍，37℃再孵育40分钟。③胞外荧光剂的洗脱：为防止胞外fluor-3/Am对检测的干扰，孵育后用平衡盐溶液冲洗3次，最后用平衡盐溶液制成细胞悬液，细胞浓度为106个/ml，37℃水浴10分钟备用。④加受试药及测定细胞内钙：分三组。1)E3组：E3组浓度为1×10-5mM/L。2)TAM组：TAM浓度为4mCg/L。3)对照组：不加受试药。用流式细胞仪进行荧光值测定(仪器系数：激发光波长505nm,发射光波长525nm)，每次加受试药前用半分钟测定静息状态的荧光值，加受试药后继续监测3分钟，整个过程在37℃恒温下进行。⑤细胞内[Ca2+]i按下列计算：
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Kd代表解离常数，文献报道为400nm[2]。Fmax代表最大荧光值，其值由样品中加入钙离子载体A23187(10-5mol/L)获得。Fmin代表最小荧光值，由Hesketh等提供的方法获得[3，4]。
1.2.3 统计学处理 实验数据以平均值(x)表示，两样本均数值比较用t检验。
2 结果
2.1 E3对HT-29细胞内[Ca2+]i影响的结果 在静息状态下，胞内[Ca2+]i浓度平均为94.40nM,E3作用后，HT-29细胞内[Ca2+]i水平下降，并维持在一个较低水平，其平均浓度为27.88nM，与静息状态胞内[Ca2+]i水平相比有显著性差异(P<0.05)(见表1)。
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2.2 TAM对HT-29细胞内[Ca2+]i影响的结果 在静息状态下，胞内[Ca2+]i浓度平均为107.88nM,TAM作用后，HT-29细胞内[Ca2+]i水平在1分钟内上升，其后维持在一个较高水平，其平均浓度为349.97nM，与静息状态胞内[Ca2+]i水平相比有显著性差异(P<0.05)(见表1)。
2.3 对照组胞内[Ca2+]i水平的结果 监测对照组3分钟，胞内钙离子浓度变化不大，平均浓度为126.62nM，较E3及TAM处理后胞内[Ca2+]i浓度有显著性差异(P<0.05)(见表1)。
表1.本实验胞内[Ca2+]i监测的结果 单位：nM 时 间
(秒)
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0
10
30
60
90
120
150
180
X
E3
105nM
94.40
17.69
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17.69
19.11
35.46
33.92
27.88
43.22
27.88*
TAM
4mCg/L
107.88
323.16
319.10
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357.40
331.43
385.28
380.49
352.94
349.97
Control
116.34
118.14
118.14
131.60
127.04
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136.24
143.36
122.12
126.62
*与静息状态相比有显著性差异(P<0.05)；**与静息状态相比有显著性差异(P<0.05)。 3 讨论
传统的观念认为甾体激素是通过控制基因活性，诱导基因表达，从而调节机体功能。近年来，有学者[5]提出甾体激素还可以通过相应的膜受体，经钙离子通道起到非基因的快速调节作用。Peter等[6]在研究孕酮和17α-羟孕酮时发现孕酮和17α-羟孕酮可引起获能的精子以及未获能的精子细胞内[Ca2+]i水平升高，而雌二醇、雌酮、皮质酮等甾体激素则不引起精子细胞内[Ca2+]i水平升高。本实验也发现E3不引起人结肠癌细胞内[Ca2+]i水平升高，与Peter等的研究结果一致。因此我们认为E3促肿瘤细胞增殖的机理符合甾体激素的基因调节作用，未见与经钙离子通道的非基因快速调节作用有关。
, 百拇医药
雌激素受体抑制剂三苯氧胺目前主要用于治疗乳腺癌，其作用机理主要是在肿瘤细胞水平通过与ER结合，竞争性抑制雌二醇而产生治疗作用。近年来，越来越多的实验和临床资料〔7〕表明TAM不仅仅是竞争性结合ER，而且亦影响其他细胞内物质，如改变胞内游离钙离子浓度，抑制Ca2+依赖性蛋白激酶C等，从而影响癌细胞的生长。Jain等〔8〕用1×10-5mol/L或更高浓度的三苯氧胺处理乳腺癌细胞MCF-7细胞3天，细胞内钙离子浓度缓慢升高。三苯氧胺诱导钙离子浓度升高先于细胞内空泡形成，空泡消失后，细胞死亡，约有10%细胞继续存活一段时间，但形态退化，最后死亡。本实验亦发现TAM可引起细胞内游离钙离子明显增高，其结果与Jain等的一致。因此我们认为TAM抑制肿瘤细胞增殖作用的机理，除竞争ER外，还可通过改变胞内游离钙离子浓度，抑制Ca2+依赖性蛋白激酶C等，最终抑制肿瘤细胞的增殖，提示TMA可用于非性激素靶器官肿瘤(如胃肠道肿瘤)的治疗。临床应用还有待进一步研究。■
, 百拇医药
参考文献：
[1] 谭端军，汪鸿志；雌激素受体的特征及与胃肠道肿瘤的关系。临床消化病杂志1996；8(2)∶71。
[2] Minte A，Kao Joseph P.Y and Tsien R.Y.Fluorescent indicators for cytosolic calcium based an rhodamine and fluorescein chromophores.J Biol Chem.1989；264∶8171.
[3] Vandenberghe P.A and Ceuppens J.L.Flow cytometric measurement of cytoplasmic free calcium in human peripheral blood Tlymphocytes with fluor-3，a new fluorescent calcium indicater.Journal of lmmunological Methods.1990；127～197.
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[4] Hesketh TR.Free cytoplasmic calcium concentration and the mitogenic stimulation of lymphocytoes.J Biol Chem.1983；258∶4876.
[5] 周浩，黄大有，邱学才：糖皮质激素对肝细胞内游离钙的作用。生物化学杂志1994；10(5)∶544。
[6] Peter F.B，Stephen JB，Denglas R.D，et al.Progesterone and 17a-hydroxyprogesterone∶Novel stimulant of calcium influx in human sperm.J Biol chem.1990；265(3)∶1376.
[7] 王哲海，孔莉，陈黎：他膜昔芬治疗非乳癌恶性肿瘤的研究现状。国外医药合成药、生化药制剂册 1993；14(1)∶24。
[8] 王俊杰，申文江：三苯氧胺抗肿瘤的分子生物学机制。国外医学肿瘤分册1997；24(6)∶335。
收稿日期：2000-01-09, 百拇医药
单位：黄兴兰(华西医科大学附属第一医院消化内科(成都 610041)； 吴浩(华西医科大学附属第一医院消化内科(成都 610041)； 陈斌(华西医科大学附属第一医院消化内科(成都 610041)； 张正(华西医科大学附属第一医院消化内科(成都 610041)
关键词：雌三醇；三苯氧胺；结肠癌；胞内游离钙离子
华西医学000173 摘 要：目的：探讨雌三醇(E3)及三苯氧胺(TAM)对人结肠癌细胞内游离钙离子([Ca2+]i)水平的影响及其意义。方法：采用流式细胞仪动态检测E3及TAM作用后，人结肠癌细胞内[Ca2+]i水平的变化。结果：①E3使细胞内[Ca2+]i水平下降，并维持在一个较低水平(27.88nM)，与静息状态细胞内[Ca2+]i水平(94.40nM)相比有显著性差异(P<0.05)。②TAM使细胞内[Ca2+]i水平上升，并维持在一个较高水平(349.97nM)，与静息状态细胞内[Ca2+]i水平(107.88nM)相比有显著性差异(P<0.05)。结论：①E3不引起胞内[Ca2+]i水平升高，E3促人结肠癌细胞增殖作用的机理符合甾体激素的基因调节作用，未见与钙离子通道的非基因的快速调节作用有关。②TAM抑制人结肠癌细胞增殖的机理，除通过竞争性结合雌激素受体外，还可能通过了改变胞内[Ca2+]i浓度等途径。
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分类号：R735.3+6；R458+7 文献标识码：A
文章编号：1002-0179(2000)01-0100-02
Effect of Estriol and Tamoxifen on the Concentration of Intracellular Free Calcium in Human Colonic Cancer Cells
HUANG Xing-lan WU Hao CHEN Bin
(Department of Gastroenterology，The First University Hospital，West China University of Medical Science，Chengdu 610041.)
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Abstract：Object：To study the effect of estriol(E3)and tamoxifen (TAM)on the concentration of intracellular free，calcium in human colonic cancer cells and analyses the significance of the effect.Methods：Flow cytometry was used to continuously monitor the change of the intracellular free calcium([Ca2+]i) in human colonic cancer cells(HT-29 cells )treated with E3 and TAM.Results：First，E3 made the intracellular [Ca2+]i concentrations maintained a lower level (27.88nM)and was much lower than that of the intracellular [Ca2+]i of static status cells(94.4nM).There was statistically difference between 27.88nM and 94.4nM(P<0.05).Secondly，TAM made the intracellular [Ca2+]i level increase.Then the intracellular [Ca2+]i level maintained a higher level (349.97nM)and was much higher than that of the intracellular[Ca2+]i of static status cells(107.88nM).There was statistically difference between 349.97 nM and 107.88nM(P<0.05).Conclusion：① E3 can not cause the intracellular [Ca2+]i increase.The effect mechanism of E3 due to the effect of gene regulation，but not the effect of rapid non-gene regulation by Ca2+ cannel.② TAM can inhibit the proliferation of cancer cells by changing the intracellular [Ca2+]i of concentration and competitively combine the estrogen receptor.
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Key words：Estriol；Tamoxifen；Colonic cancer；Intracellular free calcium.▲
雌激素受体(ER)可存在于部分胃肠道等非性激素靶器官肿瘤细胞中，这些受体具有生物活性[1]，雌激素可刺激ER阳性的肿瘤细胞生长，而雌激素受体拮抗剂三苯氧胺可抑制肿瘤的生长，其作用可能与胞内钙通道有关。本实验用E3及TAM作用于HT-29人结肠癌细胞株，用流式细胞仪动态监测细胞内[Ca2+]i水平，以探讨E3及TAM的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料 HT-29人结肠癌细胞系从湖南医科大学肿瘤研究所引种，由我院内科实验室传代培养；TAM购自上海华联制药有限公司；E3购自上海制药十二厂；fluor-3/Am购自Sigma公司；流式细胞仪系美国COULER公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 E3先用乙醇溶解(乙醇终浓度<0.1%>)，然后用PBS液稀释至工作浓度；TAM用PBS液溶解、过滤、稀释至工作浓度；小牛血清用活性碳10g/L、葡聚糖T 70lg/L，50℃搅拌30分钟，以清除游离雌激素。
1.2.2 流式细胞仪测细胞内[Ca2+]i浓度：①细胞悬液的制备：HT-29细胞在含10%小牛血清1640培养液中培养72小时，实验前换为无血清1640培养液继续培养24小时，用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化后制成单细胞悬液，细胞浓度为107个/ml左右。②荧光剂负载：在制备好的细胞悬液中加入flour-3/Am，以10μM浓度，37℃孵育20分钟后，用1640培养液稀释5倍，37℃再孵育40分钟。③胞外荧光剂的洗脱：为防止胞外fluor-3/Am对检测的干扰，孵育后用平衡盐溶液冲洗3次，最后用平衡盐溶液制成细胞悬液，细胞浓度为106个/ml，37℃水浴10分钟备用。④加受试药及测定细胞内钙：分三组。1)E3组：E3组浓度为1×10-5mM/L。2)TAM组：TAM浓度为4mCg/L。3)对照组：不加受试药。用流式细胞仪进行荧光值测定(仪器系数：激发光波长505nm,发射光波长525nm)，每次加受试药前用半分钟测定静息状态的荧光值，加受试药后继续监测3分钟，整个过程在37℃恒温下进行。⑤细胞内[Ca2+]i按下列计算：
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Kd代表解离常数，文献报道为400nm[2]。Fmax代表最大荧光值，其值由样品中加入钙离子载体A23187(10-5mol/L)获得。Fmin代表最小荧光值，由Hesketh等提供的方法获得[3，4]。
1.2.3 统计学处理 实验数据以平均值(x)表示，两样本均数值比较用t检验。
2 结果
2.1 E3对HT-29细胞内[Ca2+]i影响的结果 在静息状态下，胞内[Ca2+]i浓度平均为94.40nM,E3作用后，HT-29细胞内[Ca2+]i水平下降，并维持在一个较低水平，其平均浓度为27.88nM，与静息状态胞内[Ca2+]i水平相比有显著性差异(P<0.05)(见表1)。
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2.2 TAM对HT-29细胞内[Ca2+]i影响的结果 在静息状态下，胞内[Ca2+]i浓度平均为107.88nM,TAM作用后，HT-29细胞内[Ca2+]i水平在1分钟内上升，其后维持在一个较高水平，其平均浓度为349.97nM，与静息状态胞内[Ca2+]i水平相比有显著性差异(P<0.05)(见表1)。
2.3 对照组胞内[Ca2+]i水平的结果 监测对照组3分钟，胞内钙离子浓度变化不大，平均浓度为126.62nM，较E3及TAM处理后胞内[Ca2+]i浓度有显著性差异(P<0.05)(见表1)。
表1.本实验胞内[Ca2+]i监测的结果 单位：nM 时 间
(秒)
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0
10
30
60
90
120
150
180
X
E3
105nM
94.40
17.69
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17.69
19.11
35.46
33.92
27.88
43.22
27.88*
TAM
4mCg/L
107.88
323.16
319.10
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357.40
331.43
385.28
380.49
352.94
349.97
Control
116.34
118.14
118.14
131.60
127.04
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136.24
143.36
122.12
126.62
*与静息状态相比有显著性差异(P<0.05)；**与静息状态相比有显著性差异(P<0.05)。 3 讨论
传统的观念认为甾体激素是通过控制基因活性，诱导基因表达，从而调节机体功能。近年来，有学者[5]提出甾体激素还可以通过相应的膜受体，经钙离子通道起到非基因的快速调节作用。Peter等[6]在研究孕酮和17α-羟孕酮时发现孕酮和17α-羟孕酮可引起获能的精子以及未获能的精子细胞内[Ca2+]i水平升高，而雌二醇、雌酮、皮质酮等甾体激素则不引起精子细胞内[Ca2+]i水平升高。本实验也发现E3不引起人结肠癌细胞内[Ca2+]i水平升高，与Peter等的研究结果一致。因此我们认为E3促肿瘤细胞增殖的机理符合甾体激素的基因调节作用，未见与经钙离子通道的非基因快速调节作用有关。
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雌激素受体抑制剂三苯氧胺目前主要用于治疗乳腺癌，其作用机理主要是在肿瘤细胞水平通过与ER结合，竞争性抑制雌二醇而产生治疗作用。近年来，越来越多的实验和临床资料〔7〕表明TAM不仅仅是竞争性结合ER，而且亦影响其他细胞内物质，如改变胞内游离钙离子浓度，抑制Ca2+依赖性蛋白激酶C等，从而影响癌细胞的生长。Jain等〔8〕用1×10-5mol/L或更高浓度的三苯氧胺处理乳腺癌细胞MCF-7细胞3天，细胞内钙离子浓度缓慢升高。三苯氧胺诱导钙离子浓度升高先于细胞内空泡形成，空泡消失后，细胞死亡，约有10%细胞继续存活一段时间，但形态退化，最后死亡。本实验亦发现TAM可引起细胞内游离钙离子明显增高，其结果与Jain等的一致。因此我们认为TAM抑制肿瘤细胞增殖作用的机理，除竞争ER外，还可通过改变胞内游离钙离子浓度，抑制Ca2+依赖性蛋白激酶C等，最终抑制肿瘤细胞的增殖，提示TMA可用于非性激素靶器官肿瘤(如胃肠道肿瘤)的治疗。临床应用还有待进一步研究。■
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参考文献：
[1] 谭端军，汪鸿志；雌激素受体的特征及与胃肠道肿瘤的关系。临床消化病杂志1996；8(2)∶71。
[2] Minte A，Kao Joseph P.Y and Tsien R.Y.Fluorescent indicators for cytosolic calcium based an rhodamine and fluorescein chromophores.J Biol Chem.1989；264∶8171.
[3] Vandenberghe P.A and Ceuppens J.L.Flow cytometric measurement of cytoplasmic free calcium in human peripheral blood Tlymphocytes with fluor-3，a new fluorescent calcium indicater.Journal of lmmunological Methods.1990；127～197.
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[4] Hesketh TR.Free cytoplasmic calcium concentration and the mitogenic stimulation of lymphocytoes.J Biol Chem.1983；258∶4876.
[5] 周浩，黄大有，邱学才：糖皮质激素对肝细胞内游离钙的作用。生物化学杂志1994；10(5)∶544。
[6] Peter F.B，Stephen JB，Denglas R.D，et al.Progesterone and 17a-hydroxyprogesterone∶Novel stimulant of calcium influx in human sperm.J Biol chem.1990；265(3)∶1376.
[7] 王哲海，孔莉，陈黎：他膜昔芬治疗非乳癌恶性肿瘤的研究现状。国外医药合成药、生化药制剂册 1993；14(1)∶24。
[8] 王俊杰，申文江：三苯氧胺抗肿瘤的分子生物学机制。国外医学肿瘤分册1997；24(6)∶335。
收稿日期：2000-01-09, 百拇医药