重组BCG疫苗和结核杆菌HSP65DNA疫苗免疫原性的比较研究
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作者：戴五星 郑波 皇甫永穆 黄海浪 黄翠华
单位：戴五星 郑波 皇甫永穆 黄海浪(同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室)；黄翠华(武汉市白沙洲医院)
关键词：重组BCG疫苗；HSP65 DNA疫苗；免疫原性
中华微生物学和免疫学杂志000430 【 摘要 】 目的 研究重组BCG(recombinant BCG，rBCG) 疫苗和人结核杆菌热休克蛋白(heat shock protein,HSP)65 DNA疫苗对小鼠免疫应答的影响,评价两种疫苗的免疫原性。 方法 用rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，免疫8周时,采血、 取腹腔巨噬细胞和脾脏进行实验。以NO释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以淋巴细胞刺激指数(SI)反映细胞增殖能力,以ELISA试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的IL-2和 IFN-γ的含量。 结果 rBCG疫苗以106CFU/鼠的剂量经皮下免疫小鼠后，其脾淋巴细胞的增殖能力明显高于对照组，BCG组和HSP65 DNA疫苗组(P<0.05);腹腔巨噬细胞一氧化氮(NO)的含量和血清IL-2的含量明显高于对照组(P<0.01);血清IFN- γ的含量明显高于HSP65 DNA疫苗组(P<0.05); 其余测定参数均有升高趋势, 但差异无显著性(P>0.05) 。而HSP65 DNA疫苗以50μg/鼠的剂量经肌注免疫小鼠后,其血清IL-2的含量明显高于对照组(P<0.01);血清IFN-γ的含量明显低于rBCG组(P<0.05);其余测定参数与其他各组相比差异均无显著性(P>0.05)。 结论 本实验结果显示，rBCG疫苗具有良好的免疫原性, 能明显增强BALB/c小鼠的免疫应答反应。HSP65 DNA疫苗亦能刺激机体的免疫应答，但其反应强度似乎不及rBCG疫苗。两种疫苗的临床应用前景值得进一步研究。
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Comparative study on immunogenicity from recombinant BCG to HSP65 DNA Vaccine
DAI Wuxing, ZHENG Bo, HUANGFU Yongmu,(Department of Medical Molecular Biology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030,P.R.China)
【 Abstract 】 Objective The aim of this study is to evaluate the immunogenicity of recombinant BCG(rBCG) and human Mycobacterium tuberculosis heat shock protein(HSP)65 DNA vaccine. Methods The specific pathogen-free BALB/c mice were immunized with rBCG or HSP65 DNA vaccine by sc or im. The lymphocyte stimulating index(SI), macrophage activity as well as IL-2, IFN-γ levels of the serum and culture supernatant of spleen lymphocyte were tested by the end of 8th week of inoculation. Results After immunization with rBCG vaccine in dose of 106 CFU/per capita by sc, the SI was significantly higher than those in the control group, BCG and HSP65 DNA groups (P<0.05); the macrophage activity and serum IL-2 level were also significantly higher than those in the control group (P<0.01);the serum IFN-γ level was significantly different from that of HSP65 DNA group (P<0.05); Compared with each groups. Other parameters were no significantly different(P>0.05). After immunization with HSP65 DNA vaccine in dose of 50μg/per capita by intramuscular injection, the serum IL-2 level was significantly higher than that in the control group (P<0.01);the SI and serum IFN-γ level were significantly lower than that in the rBCG group(P<0.05);compared with each groups, the macrophage activity and the culture supernatant IL-2 level of spleen lymphocyte were no significantly different(P>0.05). Conclusions The rBCG vaccine may induced stronger immune response in BALB/c mice than did the BCG and HSP65 DNA vaccine, whereas the HSP65 DNA vaccine may induced the immune response of BALB/c mice, but its stimulating effect is lower than that by the rBCG vaccine.
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【 Subject words 】 Recombinant BCG vaccine; HSP65 DNA vaccine; Immunogenicity
结核病(TB)是一种流行广,危害大的传染病。全球每年死于结核病者有300多万人,为防治TB耗去大量人力、物力。目前，由于结核杆菌抗药株的出现以及人类免疫缺陷病毒(HIV) 所致艾滋病的流行，使TB发病率和死亡率明显上升，BCG这一传统疫苗的效果受到严峻的挑战。因此,研制新型疫苗已是当务之急。分枝杆菌热休克蛋白(HSP) 既有增强免疫应答的作用,又保持了分枝杆菌本身的抗原特性。 我们的合作者英国国家医学研究院Lowrie研究小组的Silva等将分枝杆菌HSP65基因克隆到真核表达载体pCMV中, 构成裸露DNA疫苗(DNA65)。用其免疫小鼠,发现其体内CD4CD8+T淋巴细胞特异杀伤活性明显增强，具有保护小鼠对结核杆菌攻击的抵抗力〔1〕。我们采用分子生物学技术,将结核杆菌HSP70启动子和日本血吸虫26KDGST(Sj26GST) 基因同时克隆到穿梭表达质粒pBCG-2000中,转化BCG构成重组BCG疫苗。 构建此疫苗旨在使其既能防治结核病又能防治血吸虫病,达到一苗多用的目的。目前已证实此疫苗对日本血吸虫尾蚴感染力有明显拮抗作用〔2〕。至于对结核杆菌的拮抗作用有待研究。 本研究用上述两种疫苗免疫BALB/c小鼠,然后观察其对小鼠免疫应答的影响,探讨两种疫苗抗感染的机理。
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材料与方法
实验动物:雄性BALB/c小鼠,体重18±1g,购自同济医科大学实验动物中心。
菌株、质粒及主要试剂:rBCG疫苗由本室构建;BCG丹麦株,为北京生物制品研究所产品;HSP65 DNA疫苗由英国D.B.Lowrie提供; RPMI 1640购于Sigma公司; Middle Brook 7H9 Broch(M7H9)培养基(0713-17-9)和Middle Brook ACD Enrichment(0714-62)均购自DIFCO公司;IL-2和IFN-γ ELISA检测试剂盒购于美国Endogen公司;刀豆素A(ConA)、小牛血清购自北京华美生物工程公司;MTT购于Fluka公司。
分枝杆菌的培养：参照文献〔3〕。
动物免疫:雄性BALB/c小鼠28只,随机分成4组,每组7只。第1组为空白对照组，每只鼠皮下注射生理盐水0.1ml; 第2组为BCG组,每只鼠皮下注射BCG 0.1ml(106CFU);第3组为rBCG疫苗组, 每只鼠皮下注射rBCG疫苗0.1ml (106CFU);第4组为HSP65 DNA疫苗组,每只鼠肌注HSP65 DNA疫苗0.1ml(50μg)。 免疫8周时,断头处死小鼠,取血、取腹腔巨噬细胞和脾脏进行试验。
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淋巴细胞转化试验与巨噬细胞NO的测定：参照文献〔4〕进行。
IL-2及IFN-γ的测定:断头取血分离血清,鼠脾淋巴细胞IL-2及IFN-γ的诱生培养参照文献〔5〕进行。采用ELISA法定量测定IL-2和IFN-γ。试剂盒为美国Endogen公司产品，按说明书操作，在DG3022酶标仪于波长450nm测吸光度(A)值，检测标准品、血清及淋巴细胞培养上清标本。以标准品的吸光度对浓度绘制标准曲线，求血清及淋巴细胞培养上清中IL-2及IFN-γ的含量。
统计分析：采用t检验。
结果
1.rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠淋巴细胞转化功能及巨噬细胞吞噬活性的影响:由表1可见，rBCG疫苗经皮下注射免疫小鼠后, 其脾淋巴细胞增殖反应能力明显高于空白对照组、BCG组及HSP65 DNA疫苗组(P<0.05);其巨噬细胞释放的NO明显高于空白对照组(P<0.01)。而HSP65 DNA疫苗经肌注免疫的鼠,其脾淋巴细胞增殖反应能力明显低于rBCG组(P<0.05);其腹腔巨噬细胞释放的NO分别为空白对照组的1.53倍和BCG组的1.06倍，但差别无显著意义(P>0.05)。
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表1 rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠淋巴细胞转化功能及巨噬细胞吞噬活性的影响
Table 1. Effect of rBCG and HSP65 DNA on mice spleen lymphocyte transformation and activity of peritoneal macrophage Groups
Number
of mice
SI(
±s)
NO×10(nmol/ml)
(±s)
, 百拇医药
Control
7
1.61±0.28
18.29±3.30
BCG
7
1.42±0.26
26.41±14.13
rBCG
7
2.26±0.43*
35.74±8.41**
, 百拇医药
HSP65 DNA
7
1.67±0.40△
28.07±17.68△△
Difference among control,BCG and HSP65 DNA groups *P<0.05；Difference between control and BCG groups △P>0.05；Compared with control groups **P<0.01；Difference between BCG and HSP65 DNA groups **P>0.05；Difference among control,BCG and rBCG groups △△P>0.05
2.rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠血清及脾淋巴细胞培养上清IL-2含量的影响:经rBCG疫苗免疫的小鼠,其血清IL-2的浓度分别为空白对照组的5.96倍,BCG组的1. 41倍和HSP65 DNA组的1.52倍,明显高于空白对照组(P<0.01)。 其脾淋巴细胞培养上清IL-2的浓度分别为空白对照组的1.44倍,BCG组的1.42倍和HSP65 DNA组的1.61倍, 但差别无显著意义(P>0.05)。HSP65 DNA疫苗免疫的鼠,其血清IL-2的浓度明显高于空白对照组(P<0.01)，与BCG和rBCG组相比无明显差异(P>0.05); 脾淋巴细胞培养上清IL-2的浓度与各组比较均无明显差异(P>0.05，表2)。
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3.rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠血清IFN-γ含量的影响：rBCG疫苗免疫的鼠,其血清IFN-γ的浓度分别为空白对照组的1.2倍,BCG组的1.13倍和HSP65 DNA组的1.37倍 ,明显高于HSP65 DNA疫苗组(P<0.05)。而HSP65 DNA疫苗免疫的鼠，其血清IFN-γ的浓度低于对照组14%，BCG组21%，明显低于rBCG组37%(P<0.05，表3)。
表2 rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠血清和脾淋巴细胞培养上清IL-2浓度的影响
Table 2. Effect of rBCG and HSP65 DNA on mice serum and culture supernatant IL-2 levels of spleen lymphocyte Groups
Number
, 百拇医药
of mice
Serum IL-2
(pg/ml)±s
Supernatant
IL-2(pg/ml)±s
Control
7
44.80± 14.76
183.57±140.57
, 百拇医药 BCG
7
189.00±120.72
185.43±120.16
rBCG
7
266.79±129.73*
263.71±181.26**
HSP65 DNA
7
175.67±89.28△
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167.71±62.71△△
Compared with control groups *P<0.01, △P<0.01；Compared with BCG and HSP65 DNA groups * P>0.05；Compared with control,BCG and HSP65 DNA groups **P>0.05；Compared with control,BCG and rBCG groups △△P>0.05表3 rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠血清IFN-γ含量的影响
Table 3. Effect of rBCG and HSP65 DNA on mice serum INF-γ levels Groups
Number of mice
Serum INF-γ(pg/ml)±s
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Control
7
1645.00±201.17
BCG
7
1737.86±199.08
rBCG
7
1970.00±331.27*
HSP65 DNA
7
1440.00±406.94△
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Compared with control and BCG groups *P>0.05, △P>0.05；Compared with HSP65 DNA group *P<0.05
讨论
rBCG疫苗接种后，机体的免疫反应主要通过细胞免疫介导。 它通过补体与单核-巨噬细胞表面甘露糖受体结合而被吞噬,并在其中生存和复制〔6〕 。 表达外来抗原和BCG自身蛋白，分泌或释放到吞噬体内,经抗原提呈细胞(APC)提取处理后,形成的抗原肽-MHCⅡ类分子或抗原肽-MHCⅠ类分子复合物被高尔基体运送到APC表面,分别供 CD4+和CD8+T细胞的TCR识别。T细胞活化后,增殖分化形成效应性Th细胞,其中TH1分泌IL-2和IFN-γ在细胞介导的免疫中发挥作用,IL-2和IFN-γ能增强抗原递呈过程,内源性IFN-γ可促使T细胞分化为TH1细胞,产生更多的IFN-γ, 起到一种正反馈调控作用。而TH2则分泌IL-4、IL-5和IL-10在抗体的产生中发挥作用〔2,7〕。本文结果显示,rBCG疫苗能明显提高BALB/c小鼠血清IL-2的含量,培养上清IL-2及血清IFN-γ的含量亦有一定程度的提高，提示rBCG疫苗能有效刺激宿主细胞产生IL-2和IFN-γ。
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DNA疫苗肌肉接种可以活化以TH1型为主的免疫反应,包括激活CD8+的CTL, CD4+的 TH1细胞及产生IgG2a为主的B淋巴细胞。本文结果显示,HSP65 DNA疫苗能明显增高BALB/c小鼠血清IL-2的含量,但是何原因引起血清IFN-γ浓度下降有待研究。
NO具有广泛的生理功能,是新近发现的一种信息分子。近年研究表明, 巨噬细胞产生的NO在抗感染中起着重要作用。IFN-γ、IL-1、IL-2、TNF-α、 GM-GSF以及LPS、BCG等均可单独或联合刺激巨噬细胞产生NO。其作用是通过诱导巨噬细胞产生诱生型一氧化氮合酶(iNOS),催化L-精氨酸的胍基氮原子与O结合为NO。NO不稳定,很快转化为其它氧化物形式如NO-2、NO-3等。NO及其衍生物统称为活性氮介质，在多种抗感染和非特异性免疫中发挥作用〔7-9〕。本文结果显示, rBCG疫苗可明显增高BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO的含量,HSP65 DNA疫苗亦可使 BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO的含量增高40%,表明巨噬细胞活性增强,有利杀灭病原体。
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综上所述,rBCG疫苗接种后,多种参数都显示其与对照组差异有显著性(P<0.05或P<0.01), 与BCG组和HSP65 DNA组相比,所有测定参数均有升高趋势,提示rBCG比BCG和HSP65 DNA有更强的免疫原性,能有效刺激BALB/c小鼠的免疫应答反应。 而HSP65 DNA疫苗虽能刺激小鼠的免疫应答,但其免疫原性不及rBCG和BCG疫苗。
基金项目：国家自然科学基金(NO 39480042)和卫生部基金(NO 94-1-144)资助项目
参考文献
1，Tascon RE, Colslon MJ,Lowrie DB,et al. Vaccination against tuberculosis by DNA injection. Nature Medicine, 1996,2:818-824.
2，李文桂,石佑恩,汪燕鸣,等.血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗接种后保护力的观察. 同济医科大学学报,1999,28:13-16.
, 百拇医药
3，Lowrie DB,Tascon RE,Silva CL.Vaccination against tuberculosis. International Archives of Allergy and Immunology, Switzerland, 1995,108;309-312.
4，程继忠,郑波,肖红,等.结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究.中华微生物学和免疫学杂志,1998,18:337-341.
5，沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术.湖北省科学出版社,1998,261,277.
6，Schlesinger LS. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptor in addition to complement receptor. J Immunol, 1993, 150: 2920-2930.
, 百拇医药
7，Yang J, Mitsuyama M. An essential role for endogenous interferon- γ in the genenation of protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Immunology, 1997,91:529-535.
8，Chang RH, Linfeng MH, Liu WH, et al. Nitric oxide increased interleukin-4 expression in T lymphocytes. Immunology, 1997,90:364-369.
9，Aggard E. Nitric oxide: mediator, murderer and medicine. Lancet, 1994,343:1199-1206.
(收稿日期：1999-07-05), http://www.100md.com
单位：戴五星 郑波 皇甫永穆 黄海浪(同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室)；黄翠华(武汉市白沙洲医院)
关键词：重组BCG疫苗；HSP65 DNA疫苗；免疫原性
中华微生物学和免疫学杂志000430 【 摘要 】 目的 研究重组BCG(recombinant BCG，rBCG) 疫苗和人结核杆菌热休克蛋白(heat shock protein,HSP)65 DNA疫苗对小鼠免疫应答的影响,评价两种疫苗的免疫原性。 方法 用rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，免疫8周时,采血、 取腹腔巨噬细胞和脾脏进行实验。以NO释放量检测巨噬细胞吞噬活性,以淋巴细胞刺激指数(SI)反映细胞增殖能力,以ELISA试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的IL-2和 IFN-γ的含量。 结果 rBCG疫苗以106CFU/鼠的剂量经皮下免疫小鼠后，其脾淋巴细胞的增殖能力明显高于对照组，BCG组和HSP65 DNA疫苗组(P<0.05);腹腔巨噬细胞一氧化氮(NO)的含量和血清IL-2的含量明显高于对照组(P<0.01);血清IFN- γ的含量明显高于HSP65 DNA疫苗组(P<0.05); 其余测定参数均有升高趋势, 但差异无显著性(P>0.05) 。而HSP65 DNA疫苗以50μg/鼠的剂量经肌注免疫小鼠后,其血清IL-2的含量明显高于对照组(P<0.01);血清IFN-γ的含量明显低于rBCG组(P<0.05);其余测定参数与其他各组相比差异均无显著性(P>0.05)。 结论 本实验结果显示，rBCG疫苗具有良好的免疫原性, 能明显增强BALB/c小鼠的免疫应答反应。HSP65 DNA疫苗亦能刺激机体的免疫应答，但其反应强度似乎不及rBCG疫苗。两种疫苗的临床应用前景值得进一步研究。
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Comparative study on immunogenicity from recombinant BCG to HSP65 DNA Vaccine
DAI Wuxing, ZHENG Bo, HUANGFU Yongmu,(Department of Medical Molecular Biology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030,P.R.China)
【 Abstract 】 Objective The aim of this study is to evaluate the immunogenicity of recombinant BCG(rBCG) and human Mycobacterium tuberculosis heat shock protein(HSP)65 DNA vaccine. Methods The specific pathogen-free BALB/c mice were immunized with rBCG or HSP65 DNA vaccine by sc or im. The lymphocyte stimulating index(SI), macrophage activity as well as IL-2, IFN-γ levels of the serum and culture supernatant of spleen lymphocyte were tested by the end of 8th week of inoculation. Results After immunization with rBCG vaccine in dose of 106 CFU/per capita by sc, the SI was significantly higher than those in the control group, BCG and HSP65 DNA groups (P<0.05); the macrophage activity and serum IL-2 level were also significantly higher than those in the control group (P<0.01);the serum IFN-γ level was significantly different from that of HSP65 DNA group (P<0.05); Compared with each groups. Other parameters were no significantly different(P>0.05). After immunization with HSP65 DNA vaccine in dose of 50μg/per capita by intramuscular injection, the serum IL-2 level was significantly higher than that in the control group (P<0.01);the SI and serum IFN-γ level were significantly lower than that in the rBCG group(P<0.05);compared with each groups, the macrophage activity and the culture supernatant IL-2 level of spleen lymphocyte were no significantly different(P>0.05). Conclusions The rBCG vaccine may induced stronger immune response in BALB/c mice than did the BCG and HSP65 DNA vaccine, whereas the HSP65 DNA vaccine may induced the immune response of BALB/c mice, but its stimulating effect is lower than that by the rBCG vaccine.
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【 Subject words 】 Recombinant BCG vaccine; HSP65 DNA vaccine; Immunogenicity
结核病(TB)是一种流行广,危害大的传染病。全球每年死于结核病者有300多万人,为防治TB耗去大量人力、物力。目前，由于结核杆菌抗药株的出现以及人类免疫缺陷病毒(HIV) 所致艾滋病的流行，使TB发病率和死亡率明显上升，BCG这一传统疫苗的效果受到严峻的挑战。因此,研制新型疫苗已是当务之急。分枝杆菌热休克蛋白(HSP) 既有增强免疫应答的作用,又保持了分枝杆菌本身的抗原特性。 我们的合作者英国国家医学研究院Lowrie研究小组的Silva等将分枝杆菌HSP65基因克隆到真核表达载体pCMV中, 构成裸露DNA疫苗(DNA65)。用其免疫小鼠,发现其体内CD4CD8+T淋巴细胞特异杀伤活性明显增强，具有保护小鼠对结核杆菌攻击的抵抗力〔1〕。我们采用分子生物学技术,将结核杆菌HSP70启动子和日本血吸虫26KDGST(Sj26GST) 基因同时克隆到穿梭表达质粒pBCG-2000中,转化BCG构成重组BCG疫苗。 构建此疫苗旨在使其既能防治结核病又能防治血吸虫病,达到一苗多用的目的。目前已证实此疫苗对日本血吸虫尾蚴感染力有明显拮抗作用〔2〕。至于对结核杆菌的拮抗作用有待研究。 本研究用上述两种疫苗免疫BALB/c小鼠,然后观察其对小鼠免疫应答的影响,探讨两种疫苗抗感染的机理。
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材料与方法
实验动物:雄性BALB/c小鼠,体重18±1g,购自同济医科大学实验动物中心。
菌株、质粒及主要试剂:rBCG疫苗由本室构建;BCG丹麦株,为北京生物制品研究所产品;HSP65 DNA疫苗由英国D.B.Lowrie提供; RPMI 1640购于Sigma公司; Middle Brook 7H9 Broch(M7H9)培养基(0713-17-9)和Middle Brook ACD Enrichment(0714-62)均购自DIFCO公司;IL-2和IFN-γ ELISA检测试剂盒购于美国Endogen公司;刀豆素A(ConA)、小牛血清购自北京华美生物工程公司;MTT购于Fluka公司。
分枝杆菌的培养：参照文献〔3〕。
动物免疫:雄性BALB/c小鼠28只,随机分成4组,每组7只。第1组为空白对照组，每只鼠皮下注射生理盐水0.1ml; 第2组为BCG组,每只鼠皮下注射BCG 0.1ml(106CFU);第3组为rBCG疫苗组, 每只鼠皮下注射rBCG疫苗0.1ml (106CFU);第4组为HSP65 DNA疫苗组,每只鼠肌注HSP65 DNA疫苗0.1ml(50μg)。 免疫8周时,断头处死小鼠,取血、取腹腔巨噬细胞和脾脏进行试验。
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淋巴细胞转化试验与巨噬细胞NO的测定：参照文献〔4〕进行。
IL-2及IFN-γ的测定:断头取血分离血清,鼠脾淋巴细胞IL-2及IFN-γ的诱生培养参照文献〔5〕进行。采用ELISA法定量测定IL-2和IFN-γ。试剂盒为美国Endogen公司产品，按说明书操作，在DG3022酶标仪于波长450nm测吸光度(A)值，检测标准品、血清及淋巴细胞培养上清标本。以标准品的吸光度对浓度绘制标准曲线，求血清及淋巴细胞培养上清中IL-2及IFN-γ的含量。
统计分析：采用t检验。
结果
1.rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠淋巴细胞转化功能及巨噬细胞吞噬活性的影响:由表1可见，rBCG疫苗经皮下注射免疫小鼠后, 其脾淋巴细胞增殖反应能力明显高于空白对照组、BCG组及HSP65 DNA疫苗组(P<0.05);其巨噬细胞释放的NO明显高于空白对照组(P<0.01)。而HSP65 DNA疫苗经肌注免疫的鼠,其脾淋巴细胞增殖反应能力明显低于rBCG组(P<0.05);其腹腔巨噬细胞释放的NO分别为空白对照组的1.53倍和BCG组的1.06倍，但差别无显著意义(P>0.05)。
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表1 rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠淋巴细胞转化功能及巨噬细胞吞噬活性的影响
Table 1. Effect of rBCG and HSP65 DNA on mice spleen lymphocyte transformation and activity of peritoneal macrophage Groups
Number
of mice
SI(
±s)NO×10(nmol/ml)
(
±s), 百拇医药
Control
7
1.61±0.28
18.29±3.30
BCG
7
1.42±0.26
26.41±14.13
rBCG
7
2.26±0.43*
35.74±8.41**
, 百拇医药
HSP65 DNA
7
1.67±0.40△
28.07±17.68△△
Difference among control,BCG and HSP65 DNA groups *P<0.05；Difference between control and BCG groups △P>0.05；Compared with control groups **P<0.01；Difference between BCG and HSP65 DNA groups **P>0.05；Difference among control,BCG and rBCG groups △△P>0.05
2.rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠血清及脾淋巴细胞培养上清IL-2含量的影响:经rBCG疫苗免疫的小鼠,其血清IL-2的浓度分别为空白对照组的5.96倍,BCG组的1. 41倍和HSP65 DNA组的1.52倍,明显高于空白对照组(P<0.01)。 其脾淋巴细胞培养上清IL-2的浓度分别为空白对照组的1.44倍,BCG组的1.42倍和HSP65 DNA组的1.61倍, 但差别无显著意义(P>0.05)。HSP65 DNA疫苗免疫的鼠,其血清IL-2的浓度明显高于空白对照组(P<0.01)，与BCG和rBCG组相比无明显差异(P>0.05); 脾淋巴细胞培养上清IL-2的浓度与各组比较均无明显差异(P>0.05，表2)。
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3.rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠血清IFN-γ含量的影响：rBCG疫苗免疫的鼠,其血清IFN-γ的浓度分别为空白对照组的1.2倍,BCG组的1.13倍和HSP65 DNA组的1.37倍 ,明显高于HSP65 DNA疫苗组(P<0.05)。而HSP65 DNA疫苗免疫的鼠，其血清IFN-γ的浓度低于对照组14%，BCG组21%，明显低于rBCG组37%(P<0.05，表3)。
表2 rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠血清和脾淋巴细胞培养上清IL-2浓度的影响
Table 2. Effect of rBCG and HSP65 DNA on mice serum and culture supernatant IL-2 levels of spleen lymphocyte Groups
Number
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of mice
Serum IL-2
(pg/ml)
±sSupernatant
IL-2(pg/ml)
±sControl
7
44.80± 14.76
183.57±140.57
, 百拇医药 BCG
7
189.00±120.72
185.43±120.16
rBCG
7
266.79±129.73*
263.71±181.26**
HSP65 DNA
7
175.67±89.28△
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167.71±62.71△△
Compared with control groups *P<0.01, △P<0.01；Compared with BCG and HSP65 DNA groups * P>0.05；Compared with control,BCG and HSP65 DNA groups **P>0.05；Compared with control,BCG and rBCG groups △△P>0.05表3 rBCG疫苗和HSP65 DNA疫苗对小鼠血清IFN-γ含量的影响
Table 3. Effect of rBCG and HSP65 DNA on mice serum INF-γ levels Groups
Number of mice
Serum INF-γ(pg/ml)
±s, http://www.100md.com
Control
7
1645.00±201.17
BCG
7
1737.86±199.08
rBCG
7
1970.00±331.27*
HSP65 DNA
7
1440.00±406.94△
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Compared with control and BCG groups *P>0.05, △P>0.05；Compared with HSP65 DNA group *P<0.05
讨论
rBCG疫苗接种后，机体的免疫反应主要通过细胞免疫介导。 它通过补体与单核-巨噬细胞表面甘露糖受体结合而被吞噬,并在其中生存和复制〔6〕 。 表达外来抗原和BCG自身蛋白，分泌或释放到吞噬体内,经抗原提呈细胞(APC)提取处理后,形成的抗原肽-MHCⅡ类分子或抗原肽-MHCⅠ类分子复合物被高尔基体运送到APC表面,分别供 CD4+和CD8+T细胞的TCR识别。T细胞活化后,增殖分化形成效应性Th细胞,其中TH1分泌IL-2和IFN-γ在细胞介导的免疫中发挥作用,IL-2和IFN-γ能增强抗原递呈过程,内源性IFN-γ可促使T细胞分化为TH1细胞,产生更多的IFN-γ, 起到一种正反馈调控作用。而TH2则分泌IL-4、IL-5和IL-10在抗体的产生中发挥作用〔2,7〕。本文结果显示,rBCG疫苗能明显提高BALB/c小鼠血清IL-2的含量,培养上清IL-2及血清IFN-γ的含量亦有一定程度的提高，提示rBCG疫苗能有效刺激宿主细胞产生IL-2和IFN-γ。
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DNA疫苗肌肉接种可以活化以TH1型为主的免疫反应,包括激活CD8+的CTL, CD4+的 TH1细胞及产生IgG2a为主的B淋巴细胞。本文结果显示,HSP65 DNA疫苗能明显增高BALB/c小鼠血清IL-2的含量,但是何原因引起血清IFN-γ浓度下降有待研究。
NO具有广泛的生理功能,是新近发现的一种信息分子。近年研究表明, 巨噬细胞产生的NO在抗感染中起着重要作用。IFN-γ、IL-1、IL-2、TNF-α、 GM-GSF以及LPS、BCG等均可单独或联合刺激巨噬细胞产生NO。其作用是通过诱导巨噬细胞产生诱生型一氧化氮合酶(iNOS),催化L-精氨酸的胍基氮原子与O结合为NO。NO不稳定,很快转化为其它氧化物形式如NO-2、NO-3等。NO及其衍生物统称为活性氮介质，在多种抗感染和非特异性免疫中发挥作用〔7-9〕。本文结果显示, rBCG疫苗可明显增高BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO的含量,HSP65 DNA疫苗亦可使 BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO的含量增高40%,表明巨噬细胞活性增强,有利杀灭病原体。
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综上所述,rBCG疫苗接种后,多种参数都显示其与对照组差异有显著性(P<0.05或P<0.01), 与BCG组和HSP65 DNA组相比,所有测定参数均有升高趋势,提示rBCG比BCG和HSP65 DNA有更强的免疫原性,能有效刺激BALB/c小鼠的免疫应答反应。 而HSP65 DNA疫苗虽能刺激小鼠的免疫应答,但其免疫原性不及rBCG和BCG疫苗。
基金项目：国家自然科学基金(NO 39480042)和卫生部基金(NO 94-1-144)资助项目
参考文献
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(收稿日期：1999-07-05), http://www.100md.com