IL-6和B7双基因转染的小鼠EL-4肿瘤细胞诱导抗肿瘤免疫作用
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37c医学网
作者：郝洁 博晓真 谢蜀生
单位：北京大学基础医学院免疫学系，北京 100083
关键词：转染；疫苗；药理学；白细胞介素6；药物协同作用；胸腺瘤
北京医科大学学报000421 [摘 要] 目的：探讨IL-6和B7双基因转染的小鼠肿瘤疫苗是否具有协同的抗肿瘤效应。方法：利用含小鼠B7分子和人IL-6分子cDNA的逆转录病毒载体pLmB7SN和pLhIL-6SN分别转染包装细胞株CRIP，经G418抗性筛选后以含有B7或IL-6外源基因的病毒颗粒感染小鼠EL-4胸腺瘤细胞，观察EL-4-IL-6、EL-4-B7、EL-4-IL-6+B7细胞在同基因宿主体内的致瘤性及作为抗肿瘤疫苗的能力。结果：相对亲本肿瘤细胞EL-4而言，单基因和双基因转染的EL-4细胞在小鼠体内的生长速度均明显减慢，小鼠存活时间均有一定延长，3种转基因的EL-4细胞经X-射线灭活后免疫小鼠，虽均未能阻止随后接种的EL-4细胞的生长，但小鼠存活时间都明显延长，IL-6和B7双基因转染的EL-4肿瘤细胞在抗肿瘤活性方面与IL-6或B7单基因转染的EL-4细胞差异无显著性。结论：与单基因表达疫苗比较，双基因表达疫苗没有表现出协同的抗肿瘤效应。
, 百拇医药
[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0354-04
The anti-tumor effect of murine EL-4 tumor cells transfected
with both of B7 and IL-6 gene
HAO Jie
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
BO Xiao-Zhen
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
XIE Shu-Sheng
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective:
To explore whether co-expression of IL-6 and B7 in EL-4 tumor cells could initiate an synergistic antitumor effect. Methods: The retroviral vectors pLmB7SN and pLhIL-6SN were transfected into the packaging cell line CRIP and the virus particles containing IL-6 or B7 gene were used to infect EL-4 tumor cells, obtaining the cell lines EL-4-IL-6, EL-4-B7 and EL-4-IL-6+B7. B6 mice were injected subcutaneously with various EL-4 transfectant cells and tumor growth conditions were observed. The vaccine potency of the above engineered EL-4 variants was analyzed. Results: When mice were immunized with the above irradiated EL-4 transfectant cells and challenged 7 days later with parental EL-4 cells, the survival time of mice was significantly prolonged. However, there is no difference between the survival time of mice vaccination with EL-4 cells transfected with double IL-6+B7 genes and single IL-6 or B7 gene. Conclusion: No synergistic antitumor immunity was observed in double IL-6+B7 genes transfected EL-4 cells.
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KEY WORDS Transfection; Vaccines/pharmacol; Interleukin-6; Drug synergin; Thymoma
(J Beijing Med Univ, 2000,32:354-357)
90年代以来人们用转基因肿瘤疫苗在小鼠模型中对其抗肿瘤免疫作用进行了广泛的研究，结果相差甚大[1，2]。IL-6是一种生物学活性广泛的细胞因子，参与细胞毒T细胞的活化，B细胞的分化[3，4]。全身使用高剂量的IL-6能导致小鼠体内的肿瘤消退[5]。B7分子是T细胞表面CD28分子的配体，CD28-B7是T细胞活化的重要信号传导通路。用导入了B7基因的小鼠肿瘤细胞接种小鼠发现，B7分子能够诱导抗肿瘤免疫应答[6]。我们选用小鼠胸腺瘤细胞EL-4作肿瘤模型，构建了带有hIL-6cDNA的逆转录病毒载体，通过逆转录病毒的介导制备了双基因转染的EL-4肿瘤细胞，从致瘤性、抗肿瘤疫苗效应等方面研究B7分子和IL-6双基因转染的肿瘤细胞是否具有增强的抗肿瘤能力。
, 百拇医药
1 材料与方法
试剂：限制性内切酶EcoRI, BamHI及λDNA/HindⅢ+EcoRI购自华美公司；牛肠道碱性磷酸酶CIAP,T4DNA连接酶及Agarose购自Promega；polybrene和MTT购自Sigma；G418和磷酸钙转染药盒购自Gibco；antiCD80-FITC购自Pharmgen；重组人IL-6标准品购自我系分子免疫室。
细菌株及载体：DH5α本室冻存；pBSF2.38,pLXSN和pLmB7SN由我校俞莉章老师惠赠。含IL-6 cDNA的质粒pBSF2.38的构建由日本Osaka大学的Toshio Hirano 等完成。
细胞株与动物：C57BL/6小鼠，6～8周龄，我校实验动物科学部提供。EL-4胸腺瘤细胞株(源于C57BL/6小鼠)、NIH3T3小鼠成纤维细胞株、ψCRIP双向性逆转录病毒包装细胞均为本室冻存；7TD1IL-6依赖株由马大龙教授惠赠。
, 百拇医药
pLhIL-6SN的构建(图1)及鉴定：EcoRI/BamHI双酶切pBSF2.38及pLXSN载体，用T4DNA连接酶将编码全长hIL-6的cDNA(约1 100 bp)和用碱性磷酸酶处理的酶切后的pLXSN载体连接起来，连接物转化DH5α感受态细胞，挑选12个克隆提取质粒，用EcoRI，BamHI进行双酶切分析，筛选，确定均为阳性克隆(图2)命名为pLhIL-6XN。基因操作按Ausubel等[8]的方法进行。
图1 pLhIL-6SN逆转录病毒载体构建示意图
Figure 1 Construction of pLhIL-6SN retrovirus vector
1,pLhIL-6SN; 2,pLXSN/EcoRI+BamHI; 3,pLhIL-6SN/EcoRI+BamHI;
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4,pBSF2.38/EcoRI+BamHI; 5,λDNA/EcoRI+HindⅢ.
图2 pLhIL-6SN的内切酶鉴定
Figure 2 Restriction enzyme analysis of pLhIL-6SN
逆转录病毒的包装：利用磷酸钙转染药盒提供的方法把pLhIL-6SN和pLmB7SN分别转染包装细胞ψCRIP，2～3 d后用含200 mg.L-1G418的选择培养基筛选阳性克隆，约10～14 d可见抗性克隆。
病毒滴度的测定：按文献[7]进行。Titer为(克隆数×病毒上清稀释倍数)/(所用病毒上清体积×加G418时传代比例)。
病毒颗粒感染EL-4细胞：将ψCRIP-IL-6,ψCRIP-B7的细胞培养上清过滤除菌后，按文献[7]的方法感染EL-4细胞。
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hIL-6活性及mB7表达的检测：利用IL-6依赖的小鼠杂交瘤细胞系7TD1及MTT法测定IL-6生物活性；FACS检测B7表达。
EL-4-IL-6/B7(EL-4-D)细胞的制备及表达的检测：用ψCRIP-IL-6细胞培养上清感染EL-4-B7细胞，利用依赖株法测定IL-6生物活性。
小鼠荷瘤实验：分别取1×105的EL-4、EL-4-IL-6、EL-4-B7和EL-4-D细胞接种C57BL/6小鼠背部皮下，观察肿瘤结节生长及小鼠存活时间。
疫苗的免疫保护实验：分别取1×106X-射线灭活的EL-4、EL-4-IL-6、EL-4-B7和EL-4-IL-6/B7细胞于小鼠一侧前肢皮下接种免疫，7 d后以1×105的EL-4细胞于小鼠另一侧前肢皮下接种，观察肿瘤结节的生长及小鼠的存活时间。
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统计学处理：数据以
±s表示。各组小鼠肿瘤结节生长速度的比较采用SAS软件，GLM过程做方差分析。各组小鼠存活期的比较采用Excel软件，做t检验。
2 结果
包装细胞病毒滴度测定：分别收获ψCRIP-IL-6,ψCRIP-B7细胞24 h培养上清，感染NIH3T3细胞，检测病毒滴度，结果可见：3株ψCRIP-IL-6的病毒滴度分别为1.1×105、1×105、0.3×105 CFU.ml-1；3株ψCRIP-B7的病毒滴度分别为0.5×103、1.2×103、3×103CFU.ml-1。
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pLhIL-6SN基因表达的鉴定：用7TD1IL-6依赖株，MTT法检测0.5×106 ml-1培养液EL-4-IL-6细胞24 h上清中的IL-6活性，重组人的IL-6作为标准，做IL-6标准曲线(图3)对照，测得EL-4-IL-6产生hIL-6水平为100 U.ml-1, EL-4-IL-6/B7细胞为60 U.ml-1, EL-4产生IL-6的水平为0。
Quasi-liner regression curve formed by least square principle.
The correlation coefficient is -0.987, the slop
, 百拇医药
is -0.0237 and the intercept is 0.3425.
图3 MTT法IL-6标准曲线
Figure 3 IL-6 standard curve demonstrated by MTT
pLmB7SN基因表达的鉴定：FACS检测显示，EL-4-B7细胞B7分子的表达水平为49.2%，而EL-4细胞，没有B7分子的表达。
小鼠荷瘤实验：所有转基因肿瘤细胞都长成实体瘤，接种EL-4-IL-6，EL-4-B7和EL-4-D细胞的小鼠存活期有所延长，分别为(31.4±1.3) d、(33.2±2.2) d、(33.8±2.2) d，较对照组(接种EL-4细胞组)的小鼠存活期(23.8±2.2) d差异有显著性(P<0.01)，从表1中可以看出，接种转基因细胞的肿瘤结节生长速度较对照组明显减慢(P<0.01)，表明转基因的肿瘤细胞在体内的生长能力降低了，但双基因转染的肿瘤细胞和转染B7基因的相比，差异无显著性(P>0.05)。
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表1 EL-4,EL-4-IL-6,EL-4-B7,EL-4-IL-6/B7细胞
在C57BL/6小鼠皮下的生长情况(±s, n=5)
Table 1 Subcutaneous tumor growth in C57BL/6 mice injected
with EL-4, EL-4-IL-6, EL-4-B7,EL-4-IL-6/B7 cells (±s, n=5) t/d t/d
EL-4
EL-4-IL-6
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EL-4-B7
EL-4-D
6
2.5±1.6
0
0
0
9
7.8±1.0
3.5±0.6
2.5±1.5
0
12
, 百拇医药
12.2±1.5
5.3±1.0
3.5±0.9
3.8±0.9
15
16.8±2.5
10.3±1.8
7.7±2.5
7.3±2.5
18
21.1±2.6
15.5±2.3
, 百拇医药
11.5±1.7
9.3±2.6
21
26.5±2.5
18.8±1.9
14.2±2.6
11.5±1.6
24
29.7±2.3
20.6±2.4
16.7±1.8
14.8±2.6
, 百拇医药
27
0
22.0±2.2
18.5±2.3
16.8±2.5
30
0
23.5±1.5
19.5±1.7
18.0±2.1
疫苗的免疫保护实验：以X-射线灭活的肿瘤细胞作为疫苗免疫小鼠，观察对随后亲本细胞攻击的保护作用。表2和图4显示，X-射线灭活的亲本EL-4细胞也能诱导出一定的免疫保护作用，但转基因疫苗与之比较，肿瘤结节的生长速度明显减慢，存活期也显著延长，说明转基因疫苗的免疫原性显著增强，诱导机体产生了增强的抗瘤效应，但双基因疫苗并没有表现出协同的增强免疫保护的作用。
, 百拇医药
EL-4* is the group injected with EL-4 cells subcutaneously;
** P<0.01， compared with control group； n=5.
图4 皮下接种灭活疫苗7天后接种EL-4细胞
对小鼠存活时间的影响
Figure 4 The survival period of mice injected with EL-4 cells
on 7 days after irradiated tumor cells inoculation
表2 皮下接种灭活疫苗7 d后接种EL-4细胞在小鼠皮下的生长情况(±s)
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Table 2 Subcutaneous tumor growth in C57BL/6 mice injected with
EL-4 cells on 7 days after irradiated tumor cells inoculation (±s)
t/d t/d
EL-4*＃
EL-4
EL-4-IL-6＃△
EL-4-B7＃△△
EL-4-D＃
, 百拇医药
12
12.2±1.5
6.0±2.1
4.3±1.1
2.5±1.7
0
15
16.8±2.5
7.3±2.5
5.3±1.0
3.5±1.2
2.8±1.6
, 百拇医药 18
21.1±2.6
12.0±2.8
8.2±1.8
5.5±1.3
4.8±1.3
21
26.5±2.5
14.8±1.4
11.5±1.5
8.3±1.1
6.3±0.8
, 百拇医药
24
29.7±2.2
19.5±1.5
13.5±2.4
9.7±0.8
8.8±1.0
27
0
23.0±1.6
16.7±1.8
12.0±2.6
11.1±1.2
, 百拇医药
30
0
26.3±2.4
18.5±2.0
14.2±2.3
13.0±2.3
33
0
0
20.6±2.4
15.5±2.3
15.3±2.6
36
, 百拇医药
0
0
22.5±2.3
17.4±2.0
16.2±1.7
n=5, EL-4* is the group injected with EL-4 cells subcutaneously; #P<0.01, vs EL-4; △P<0.05, △△P>0.05, vs EL-4-D.3 讨论
T细胞在机体抗肿瘤免疫中起主要的作用。一些膜分子和细胞因子是T细胞活化的重要条件。它们的缺乏将会导致T细胞的不应答和机体的外周免疫耐受。Nakazaki等[8]将转导GM-CSF基因和B7基因的EL-4细胞混合后作为疫苗使用，发现能引起小鼠产生较单独转导GM-CSF或B7肿瘤细胞更强的抗肿瘤免疫反应，提示双基因转染同一肿瘤细胞有可能获得协同的抗肿瘤效果。
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Holsti等[9]证明，通过适量的抗CD3单抗的刺激，IL-6和B7分子能够协同促进CD4+T淋巴细胞的增殖，因此这两个因子能共同作用于CD4+和CD8+亚类的T细胞。
在本实验中，我们以小鼠EL-4胸腺瘤细胞作为模型，探讨IL-6和B7双基因转染EL-4细胞后疫苗的抗肿瘤效果。研究发现，与亲本细胞比较，单独IL-6或单独B7基因转染的EL-4细胞的肿瘤原性下降，主要表现在同系C57BL16小鼠体内肿瘤生长速度减慢，宿主存活时间适当延长。令我们意外的是，同时表达IL-6和B7的EL-4细胞虽然也表现了肿瘤原性的降低，但并没有表现出协同的增强效果。用照射灭活的疫苗免疫小鼠可获得对野生型EL-4肿瘤的免疫保护效应，在这方面，单、双基因转染的EL-4肿瘤疫苗仍没有表现出显著差异。
最近的研究表明，将B7, IL-2基因单独或联合导入小鼠乳腺癌细胞PyMT，发现同时表达B7和IL-2分子的肿瘤细胞在小鼠体内诱导了协同增强的肿瘤排斥和免疫保护作用[10]。而同样用B7和IL-2基因共转染的浆细胞瘤J558L降低的成瘤性方面和B7或IL-2单基因转染的细胞相比，并无差异，在诱导保护免疫方面甚至还不如单基因转染的肿瘤细胞[11]。这说明，不同的肿瘤对相同的基因表达产生的抗肿瘤效果是不同的。另外在细胞因子网络中，不同细胞因子之间的协同、拮抗关系十分复杂，为选择不同的基因组合带来困难。Arca等[12]对小鼠黑色素瘤B16-BL6的研究发现，转入GM-CSF+IL-4和IL-2+IL-4基因的细胞可引起宿主更强的全身抗肿瘤免疫反应，而转入GM-CSF+IL-2和GM-CSF+IFNγ基因的细胞却没有协同作用。因此，我们用转IL-6, B7双基因的EL-4肿瘤模型虽然未能对EL-4细胞取得明显的协同效果，但并不排除其它基因组合的协同作用，也并不排除这种组合对其它肿瘤细胞的协同作用。但本文的结果进一步说明了目前的这种肿瘤基因治疗在疗效上的不确定性，值得引起我们的注意。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金(39470656)资助课题；
参考文献
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12，Arca MJ, Krauss JC, Strome SE, et al. Diverse manifestations of tumorigenicity and immunogenicity displayed by the poorly immunogenic B16-BL6 melanoma transduced with cytokine genes [J]. Cancer Immunol Immunother, 1996, 42:237-245
(1999-12-28收稿), 百拇医药
单位：北京大学基础医学院免疫学系，北京 100083
关键词：转染；疫苗；药理学；白细胞介素6；药物协同作用；胸腺瘤
北京医科大学学报000421 [摘 要] 目的：探讨IL-6和B7双基因转染的小鼠肿瘤疫苗是否具有协同的抗肿瘤效应。方法：利用含小鼠B7分子和人IL-6分子cDNA的逆转录病毒载体pLmB7SN和pLhIL-6SN分别转染包装细胞株CRIP，经G418抗性筛选后以含有B7或IL-6外源基因的病毒颗粒感染小鼠EL-4胸腺瘤细胞，观察EL-4-IL-6、EL-4-B7、EL-4-IL-6+B7细胞在同基因宿主体内的致瘤性及作为抗肿瘤疫苗的能力。结果：相对亲本肿瘤细胞EL-4而言，单基因和双基因转染的EL-4细胞在小鼠体内的生长速度均明显减慢，小鼠存活时间均有一定延长，3种转基因的EL-4细胞经X-射线灭活后免疫小鼠，虽均未能阻止随后接种的EL-4细胞的生长，但小鼠存活时间都明显延长，IL-6和B7双基因转染的EL-4肿瘤细胞在抗肿瘤活性方面与IL-6或B7单基因转染的EL-4细胞差异无显著性。结论：与单基因表达疫苗比较，双基因表达疫苗没有表现出协同的抗肿瘤效应。
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[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0354-04
The anti-tumor effect of murine EL-4 tumor cells transfected
with both of B7 and IL-6 gene
HAO Jie
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
BO Xiao-Zhen
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
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XIE Shu-Sheng
(Department of Immunology, Peking University, Beijing 100083, China)
ABSTRACT Objective:
To explore whether co-expression of IL-6 and B7 in EL-4 tumor cells could initiate an synergistic antitumor effect. Methods: The retroviral vectors pLmB7SN and pLhIL-6SN were transfected into the packaging cell line CRIP and the virus particles containing IL-6 or B7 gene were used to infect EL-4 tumor cells, obtaining the cell lines EL-4-IL-6, EL-4-B7 and EL-4-IL-6+B7. B6 mice were injected subcutaneously with various EL-4 transfectant cells and tumor growth conditions were observed. The vaccine potency of the above engineered EL-4 variants was analyzed. Results: When mice were immunized with the above irradiated EL-4 transfectant cells and challenged 7 days later with parental EL-4 cells, the survival time of mice was significantly prolonged. However, there is no difference between the survival time of mice vaccination with EL-4 cells transfected with double IL-6+B7 genes and single IL-6 or B7 gene. Conclusion: No synergistic antitumor immunity was observed in double IL-6+B7 genes transfected EL-4 cells.
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KEY WORDS Transfection; Vaccines/pharmacol; Interleukin-6; Drug synergin; Thymoma
(J Beijing Med Univ, 2000,32:354-357)
90年代以来人们用转基因肿瘤疫苗在小鼠模型中对其抗肿瘤免疫作用进行了广泛的研究，结果相差甚大[1，2]。IL-6是一种生物学活性广泛的细胞因子，参与细胞毒T细胞的活化，B细胞的分化[3，4]。全身使用高剂量的IL-6能导致小鼠体内的肿瘤消退[5]。B7分子是T细胞表面CD28分子的配体，CD28-B7是T细胞活化的重要信号传导通路。用导入了B7基因的小鼠肿瘤细胞接种小鼠发现，B7分子能够诱导抗肿瘤免疫应答[6]。我们选用小鼠胸腺瘤细胞EL-4作肿瘤模型，构建了带有hIL-6cDNA的逆转录病毒载体，通过逆转录病毒的介导制备了双基因转染的EL-4肿瘤细胞，从致瘤性、抗肿瘤疫苗效应等方面研究B7分子和IL-6双基因转染的肿瘤细胞是否具有增强的抗肿瘤能力。
, 百拇医药
1 材料与方法
试剂：限制性内切酶EcoRI, BamHI及λDNA/HindⅢ+EcoRI购自华美公司；牛肠道碱性磷酸酶CIAP,T4DNA连接酶及Agarose购自Promega；polybrene和MTT购自Sigma；G418和磷酸钙转染药盒购自Gibco；antiCD80-FITC购自Pharmgen；重组人IL-6标准品购自我系分子免疫室。
细菌株及载体：DH5α本室冻存；pBSF2.38,pLXSN和pLmB7SN由我校俞莉章老师惠赠。含IL-6 cDNA的质粒pBSF2.38的构建由日本Osaka大学的Toshio Hirano 等完成。
细胞株与动物：C57BL/6小鼠，6～8周龄，我校实验动物科学部提供。EL-4胸腺瘤细胞株(源于C57BL/6小鼠)、NIH3T3小鼠成纤维细胞株、ψCRIP双向性逆转录病毒包装细胞均为本室冻存；7TD1IL-6依赖株由马大龙教授惠赠。
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pLhIL-6SN的构建(图1)及鉴定：EcoRI/BamHI双酶切pBSF2.38及pLXSN载体，用T4DNA连接酶将编码全长hIL-6的cDNA(约1 100 bp)和用碱性磷酸酶处理的酶切后的pLXSN载体连接起来，连接物转化DH5α感受态细胞，挑选12个克隆提取质粒，用EcoRI，BamHI进行双酶切分析，筛选，确定均为阳性克隆(图2)命名为pLhIL-6XN。基因操作按Ausubel等[8]的方法进行。
图1 pLhIL-6SN逆转录病毒载体构建示意图
Figure 1 Construction of pLhIL-6SN retrovirus vector
1,pLhIL-6SN; 2,pLXSN/EcoRI+BamHI; 3,pLhIL-6SN/EcoRI+BamHI;
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4,pBSF2.38/EcoRI+BamHI; 5,λDNA/EcoRI+HindⅢ.
图2 pLhIL-6SN的内切酶鉴定
Figure 2 Restriction enzyme analysis of pLhIL-6SN
逆转录病毒的包装：利用磷酸钙转染药盒提供的方法把pLhIL-6SN和pLmB7SN分别转染包装细胞ψCRIP，2～3 d后用含200 mg.L-1G418的选择培养基筛选阳性克隆，约10～14 d可见抗性克隆。
病毒滴度的测定：按文献[7]进行。Titer为(克隆数×病毒上清稀释倍数)/(所用病毒上清体积×加G418时传代比例)。
病毒颗粒感染EL-4细胞：将ψCRIP-IL-6,ψCRIP-B7的细胞培养上清过滤除菌后，按文献[7]的方法感染EL-4细胞。
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hIL-6活性及mB7表达的检测：利用IL-6依赖的小鼠杂交瘤细胞系7TD1及MTT法测定IL-6生物活性；FACS检测B7表达。
EL-4-IL-6/B7(EL-4-D)细胞的制备及表达的检测：用ψCRIP-IL-6细胞培养上清感染EL-4-B7细胞，利用依赖株法测定IL-6生物活性。
小鼠荷瘤实验：分别取1×105的EL-4、EL-4-IL-6、EL-4-B7和EL-4-D细胞接种C57BL/6小鼠背部皮下，观察肿瘤结节生长及小鼠存活时间。
疫苗的免疫保护实验：分别取1×106X-射线灭活的EL-4、EL-4-IL-6、EL-4-B7和EL-4-IL-6/B7细胞于小鼠一侧前肢皮下接种免疫，7 d后以1×105的EL-4细胞于小鼠另一侧前肢皮下接种，观察肿瘤结节的生长及小鼠的存活时间。
, http://www.100md.com
统计学处理：数据以
±s表示。各组小鼠肿瘤结节生长速度的比较采用SAS软件，GLM过程做方差分析。各组小鼠存活期的比较采用Excel软件，做t检验。2 结果
包装细胞病毒滴度测定：分别收获ψCRIP-IL-6,ψCRIP-B7细胞24 h培养上清，感染NIH3T3细胞，检测病毒滴度，结果可见：3株ψCRIP-IL-6的病毒滴度分别为1.1×105、1×105、0.3×105 CFU.ml-1；3株ψCRIP-B7的病毒滴度分别为0.5×103、1.2×103、3×103CFU.ml-1。
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pLhIL-6SN基因表达的鉴定：用7TD1IL-6依赖株，MTT法检测0.5×106 ml-1培养液EL-4-IL-6细胞24 h上清中的IL-6活性，重组人的IL-6作为标准，做IL-6标准曲线(图3)对照，测得EL-4-IL-6产生hIL-6水平为100 U.ml-1, EL-4-IL-6/B7细胞为60 U.ml-1, EL-4产生IL-6的水平为0。
Quasi-liner regression curve formed by least square principle.
The correlation coefficient is -0.987, the slop
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is -0.0237 and the intercept is 0.3425.
图3 MTT法IL-6标准曲线
Figure 3 IL-6 standard curve demonstrated by MTT
pLmB7SN基因表达的鉴定：FACS检测显示，EL-4-B7细胞B7分子的表达水平为49.2%，而EL-4细胞，没有B7分子的表达。
小鼠荷瘤实验：所有转基因肿瘤细胞都长成实体瘤，接种EL-4-IL-6，EL-4-B7和EL-4-D细胞的小鼠存活期有所延长，分别为(31.4±1.3) d、(33.2±2.2) d、(33.8±2.2) d，较对照组(接种EL-4细胞组)的小鼠存活期(23.8±2.2) d差异有显著性(P<0.01)，从表1中可以看出，接种转基因细胞的肿瘤结节生长速度较对照组明显减慢(P<0.01)，表明转基因的肿瘤细胞在体内的生长能力降低了，但双基因转染的肿瘤细胞和转染B7基因的相比，差异无显著性(P>0.05)。
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表1 EL-4,EL-4-IL-6,EL-4-B7,EL-4-IL-6/B7细胞
在C57BL/6小鼠皮下的生长情况(
±s, n=5)Table 1 Subcutaneous tumor growth in C57BL/6 mice injected
with EL-4, EL-4-IL-6, EL-4-B7,EL-4-IL-6/B7 cells (
±s, n=5) t/d t/dEL-4
EL-4-IL-6
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EL-4-B7
EL-4-D
6
2.5±1.6
0
0
0
9
7.8±1.0
3.5±0.6
2.5±1.5
0
12
, 百拇医药
12.2±1.5
5.3±1.0
3.5±0.9
3.8±0.9
15
16.8±2.5
10.3±1.8
7.7±2.5
7.3±2.5
18
21.1±2.6
15.5±2.3
, 百拇医药
11.5±1.7
9.3±2.6
21
26.5±2.5
18.8±1.9
14.2±2.6
11.5±1.6
24
29.7±2.3
20.6±2.4
16.7±1.8
14.8±2.6
, 百拇医药
27
0
22.0±2.2
18.5±2.3
16.8±2.5
30
0
23.5±1.5
19.5±1.7
18.0±2.1
疫苗的免疫保护实验：以X-射线灭活的肿瘤细胞作为疫苗免疫小鼠，观察对随后亲本细胞攻击的保护作用。表2和图4显示，X-射线灭活的亲本EL-4细胞也能诱导出一定的免疫保护作用，但转基因疫苗与之比较，肿瘤结节的生长速度明显减慢，存活期也显著延长，说明转基因疫苗的免疫原性显著增强，诱导机体产生了增强的抗瘤效应，但双基因疫苗并没有表现出协同的增强免疫保护的作用。
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EL-4* is the group injected with EL-4 cells subcutaneously;
** P<0.01， compared with control group； n=5.
图4 皮下接种灭活疫苗7天后接种EL-4细胞
对小鼠存活时间的影响
Figure 4 The survival period of mice injected with EL-4 cells
on 7 days after irradiated tumor cells inoculation
表2 皮下接种灭活疫苗7 d后接种EL-4细胞在小鼠皮下的生长情况(
±s), http://www.100md.com
Table 2 Subcutaneous tumor growth in C57BL/6 mice injected with
EL-4 cells on 7 days after irradiated tumor cells inoculation (
±s)t/d t/d
EL-4*＃
EL-4
EL-4-IL-6＃△
EL-4-B7＃△△
EL-4-D＃
, 百拇医药
12
12.2±1.5
6.0±2.1
4.3±1.1
2.5±1.7
0
15
16.8±2.5
7.3±2.5
5.3±1.0
3.5±1.2
2.8±1.6
, 百拇医药 18
21.1±2.6
12.0±2.8
8.2±1.8
5.5±1.3
4.8±1.3
21
26.5±2.5
14.8±1.4
11.5±1.5
8.3±1.1
6.3±0.8
, 百拇医药
24
29.7±2.2
19.5±1.5
13.5±2.4
9.7±0.8
8.8±1.0
27
0
23.0±1.6
16.7±1.8
12.0±2.6
11.1±1.2
, 百拇医药
30
0
26.3±2.4
18.5±2.0
14.2±2.3
13.0±2.3
33
0
0
20.6±2.4
15.5±2.3
15.3±2.6
36
, 百拇医药
0
0
22.5±2.3
17.4±2.0
16.2±1.7
n=5, EL-4* is the group injected with EL-4 cells subcutaneously; #P<0.01, vs EL-4; △P<0.05, △△P>0.05, vs EL-4-D.3 讨论
T细胞在机体抗肿瘤免疫中起主要的作用。一些膜分子和细胞因子是T细胞活化的重要条件。它们的缺乏将会导致T细胞的不应答和机体的外周免疫耐受。Nakazaki等[8]将转导GM-CSF基因和B7基因的EL-4细胞混合后作为疫苗使用，发现能引起小鼠产生较单独转导GM-CSF或B7肿瘤细胞更强的抗肿瘤免疫反应，提示双基因转染同一肿瘤细胞有可能获得协同的抗肿瘤效果。
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Holsti等[9]证明，通过适量的抗CD3单抗的刺激，IL-6和B7分子能够协同促进CD4+T淋巴细胞的增殖，因此这两个因子能共同作用于CD4+和CD8+亚类的T细胞。
在本实验中，我们以小鼠EL-4胸腺瘤细胞作为模型，探讨IL-6和B7双基因转染EL-4细胞后疫苗的抗肿瘤效果。研究发现，与亲本细胞比较，单独IL-6或单独B7基因转染的EL-4细胞的肿瘤原性下降，主要表现在同系C57BL16小鼠体内肿瘤生长速度减慢，宿主存活时间适当延长。令我们意外的是，同时表达IL-6和B7的EL-4细胞虽然也表现了肿瘤原性的降低，但并没有表现出协同的增强效果。用照射灭活的疫苗免疫小鼠可获得对野生型EL-4肿瘤的免疫保护效应，在这方面，单、双基因转染的EL-4肿瘤疫苗仍没有表现出显著差异。
最近的研究表明，将B7, IL-2基因单独或联合导入小鼠乳腺癌细胞PyMT，发现同时表达B7和IL-2分子的肿瘤细胞在小鼠体内诱导了协同增强的肿瘤排斥和免疫保护作用[10]。而同样用B7和IL-2基因共转染的浆细胞瘤J558L降低的成瘤性方面和B7或IL-2单基因转染的细胞相比，并无差异，在诱导保护免疫方面甚至还不如单基因转染的肿瘤细胞[11]。这说明，不同的肿瘤对相同的基因表达产生的抗肿瘤效果是不同的。另外在细胞因子网络中，不同细胞因子之间的协同、拮抗关系十分复杂，为选择不同的基因组合带来困难。Arca等[12]对小鼠黑色素瘤B16-BL6的研究发现，转入GM-CSF+IL-4和IL-2+IL-4基因的细胞可引起宿主更强的全身抗肿瘤免疫反应，而转入GM-CSF+IL-2和GM-CSF+IFNγ基因的细胞却没有协同作用。因此，我们用转IL-6, B7双基因的EL-4肿瘤模型虽然未能对EL-4细胞取得明显的协同效果，但并不排除其它基因组合的协同作用，也并不排除这种组合对其它肿瘤细胞的协同作用。但本文的结果进一步说明了目前的这种肿瘤基因治疗在疗效上的不确定性，值得引起我们的注意。
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基金项目：国家自然科学基金(39470656)资助课题；
参考文献
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(1999-12-28收稿), 百拇医药