细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列分析
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37c医学网
作者：
单位：陆家海(中山医科大学 寄生虫学教研室)；余新炳(中山医科大学 寄生虫学教研室)；高劲松(中山医科大学 达安基因诊断中心)；单志新(中山医科大学 寄生虫学教研室)；陈慧红(中山医科大学 寄生虫学教研室)；郭中敏(中山医科大学 实验动物中心， 广东 广州 510089)
关键词：
00zk08摘 要：【目的】 获得细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列,并进行序列分析。【方法】 从包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节，使用TRIZOL试剂提取总RNA，逆转录成cDNA。根据E.granulosus抗原B亚单位基因的已知序列设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增出抗原B亚单位基因；将PCR产物纯化后用双脱氧链末端终止法进行序列测定，并进行序列分析。【结果】 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列，测序表明该基因ORF为270 bp,和已发表基因核苷酸序列相比，缺失3个碱基,同源性为84.2%，推导编码氨基酸序列同源性为77.8%。【结论】 从E.granulosus cDNA扩增出抗原B亚单位基因，该基因编码8 ku亚单位前体蛋白。
, 百拇医药
中图分类号： R383.3 文献标识码： A
文章编号： 100-257X(2000)04S0-0027-03
Amplify and Sequence the Antigen B Subunit Gene from Echinococcus granulosus
LU Jia-hai, YU Xin-bing, SHAN Zhi-xin, CHEN Hui-hong
( Department of Parasitology)
GAO Jin-song
(Da′an Gene Diagnostic center)
, 百拇医药
GUO Zhong-min
(Medical Laboratory Animal Center,Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
Abstract：【Objective】 To obtain and analyze the sequence of cDNA of Echinococcusgranulosus antigen B subunit gene. 【Method】 Total RNA was extracted from protoscoles of cysts from ovine origin by using TRIZOL Reagents. The specific primers were designed according to published nucleotide sequence in the GenBank database. The Echinococcus granulosus cDNA was amplified by RT-PCR. The purified product of PCR was sequenced by the dideoxy chain termination method, and sequence analyses was performed by using standard computer program. 【Results】 A cDNA sequence with an open reading frame of 270 bp has been amplified successfully by using RT-PCR. Comparison of the DNA sequence and amino acid sequence deduced from cDNA with the published 8 ku subunit sequence of Echinococcus granulosus antigen B in the GenBank revealed lack of three bases and 84.27% and 77.8% identity respectively. 【Conclusion】 Ag B subunit gene has been isolated from cDNA of E.granulosus, this gene encodes a 8 ku subunit precursory protein.
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Key words: Echinococcus granulosus; Antigen B; gene amplication; sequence analysis
在全世界牧区，包虫病仍是一个严重的公共卫生问题。该病在中东、南欧、拉丁美洲、中亚、澳大利亚、和非洲部分国家流行，在我国以甘肃、新疆、宁夏、内蒙、青海等省(区)流行严重。随着现代社会的发展，人口流动增加，宠物(犬)和经济动物(狐狸)养殖数量增加，导致包虫病蔓延扩散，很多省(区)均发现包虫病人[1]。对于人的包虫病，往往在以下情况下才被发现：寄生在身体各器官的包囊增大到一定程度而引起功能障碍时，包囊遭到创伤性破裂而引起过敏现象或体检时进行物理检查(如X射线扫描等)。尽管物理诊断如超声扫描、CT断层分析有助于确定包囊的位置大小、包囊液充盈度、是否钙化，但对它们的性质往往难以作出精确判断。因而，特异性的血清学诊断就显得尤为重要。几乎所有的试验都曾用于包虫病的诊断。但是由于诊断包虫病的抗原因其特异性差或敏感性低而使其受到限制。因此，研究者试图来寻找一种特异、敏感的抗原。目前最常用的血清学诊断抗原是包囊液，但粗制的包囊液抗原对囊虫感染有严重的交叉反应，尽管用盐析技术分离包囊液抗原提高了敏感性，但非特异反应增多。用亲和层析法对抗原进一步纯化，增加了特异性，但敏感性降低[2]。研究表明，包囊液中有2种脂蛋白抗原(即抗原5和抗原B)，是具有十分特异的包虫病诊断抗原。通常用肝素亲和层析法来分离包囊液中的抗原5和抗原B，用于包虫病的诊断，具有很高的敏感性和特异性。然而由于制备这些抗原需要长期不断提供包囊液，同时用包囊液进行纯化抗原要求条件高，且因宿主自身抗原的存在而出现假阳性结果。理论上，重组抗原有助于解决上述弊端。基于此，本研究根据抗原B基因的发表序列，从我国新疆包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节，分离RNA，采用RT-PCR扩增抗原B亚单位前体蛋白基因，并进行测序鉴定，为进一步克隆表达和实际应用奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 细粒棘球蚴原头节的收集
从乌鲁木齐四桥屠宰场屠宰的包虫病羊，获取含包囊的肝脏，无菌条件下完整获取包囊，抽取包囊液，分离原头节，经PBS(pH 7.2)两次洗涤后，镜下观察其活力，然后放入液氮中保存备用。
1.2 主要酶类和其它试剂
Taq DNA聚合酶(5×106 U/L)，dNTP购自TakaRa公司，TRIZOL试剂，MMLV逆转录酶购自Gibco BRL公司。PCR系列试剂购自大连宝生物公司。
1.3 PCR引物
根据已报道的细粒棘球蚴抗原B亚单位前体蛋白基因cDNA序列经pcGENE软件分析设计引物[3]：引物1：5′-GCGTCGACATGAGGACTTACA-TCCTTCTCTC-3′，对应于抗原B的开放读框(ORF)41～63 bp；引物2：5′-GCCTCGAGTT-ACTTTGAATCATCATCTTTTTC-3′，对应于E.granulosus抗原B ORF中的289～313 bp。在两条引物加上保护性碱基GC，为了便于PCR产物的克隆，在引物1和引物2的两端分别引入一个SalⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物由大连宝生物公司合成。
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1.2 方 法
1.2.1 E.granulosus原头节总RNA的提取 取新鲜或液氮中冻存的E.granulosus原头节100 mg,使用TRIZOL(LIFE TECHNOLOGIES)试剂抽提总RNA，紫外分光光度计测定其含量，琼脂糖电泳鉴定其纯度。
1.2.2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 其组成和反应条件：5×RT Buffer 2 μL,10 mmol dNTP 1 μL,MMLV 1 μL,RNA 5 μL, Oligo(dT)1 μL，37 ℃ 1 h,95 ℃ 3 min。然后进行PCR，其组成和反应条件为：5×PCR Buffer 5 μL,2 mmol dNTP 2.5 μL,Tag 酶0.5 μL,引物1和引物2各1 μL,cDNA 1 μL, H2O 14 μL。94 ℃ 3 min,85 ℃ 30 s;93 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min,10 个循环;93 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30个循环。
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1.2.3 PCR产物的纯化、鉴定和序列测定 将PCR产物进行琼脂糖电泳，鉴定其大小是否与预期基因片段大小相符；然后将PCR产物纯化后，用上述引物(P1和P2)为测序引物，采用Sanger双脱氧链末端终止法，在ABI-373A自动测序仪上阅读碱基序列，对测序结果进行序列分析和同源性比较。
2 结 果
2.1 E.granulosus原头节RNA提取
按TRIZOL试剂抽提总RNA，紫外测定核酸含量为0.336 g/L,A260/A280=2.1,用1 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，RNA有2条带。
2.2 PCR产物的电泳鉴定
将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，扩增出符合预期大小(270 bp)的片段(图1)。
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图1 抗原B PCR产物电泳
Fig.1 Agarose electrophorosis analysis
of Antigen B PCR products
2.3 序列测定和同源性比较
从E.granulosus原头节提取RNA，依据抗原B亚单位前体基因序列设计的引物，利用RT-PCR扩增出抗原B亚单位前体基因，经序列测定和同源性比较和已发表序列的同源性为84.2%(碱基序列和推导的氨基酸序列如图2)。已发表基因ORF为273 bp,编码8 ku亚单位前体蛋白。该序列和已报告基因序列相比，缺失3个碱基(图3)。推导的氨基酸序列同源性为77.8%，和已报告的氨基酸序列相比，在36位置缺失一个氨基酸(图4)。
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图2 抗原B亚基核苷酸序列和推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid
sequence of E.granulosus Ag B subunit
GenBank accession: AF252859
图3 抗原B核苷酸同源性比较
Fig.3 Comparision of homology with other
E.granulosus Ag B variants
, 百拇医药
Alignment of Seq 1 the nucleotide sequence derived from RT-PCR and Seq 2 one of the published sequences of the 8 ku subunit of Ag B [3]
图4 氨基酸同源性比较
Fig.4 Homology is the same with the other
E.granulosus variants
Alignment of Seq 1 the amino sequence derived from RT-PCR and Seq 2 one of the published sequences of the 8 ku subunit of Ag B [3]
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3 讨 论
抗原5(Ag5)和抗原B(AgB)是两个公认的细粒棘球蚴特异抗原蛋白。曾认为Ag5在细粒棘球绦虫血清学反应中具有特异性抗原，但后来试验发现其与多房棘球蚴、囊虫和某些肠道线虫有交叉反应。AgB亦是公认的具有诊断价值的寄生虫蛋白，免疫印迹显示其最小亚基(12 ku/8 ku)可用于包虫病患者血清抗体的检测[4]。Frosch等进行了8 ku亚基的序列测定和同源性比较，显示不同地理来源的E.granulosus分离株在几个特定位置上的氨基酸种类有变动[5]。本研究扩增新疆羊源E.granulosus抗原B 8 ku亚基序列，和Frosch等所测序列的同源性为84.2%，所推导氨基酸同源性为77.8%，且在36位置缺失一个氨基酸。Fernandez等[3]分离得到8 ku亚单位cDNA克隆，其序列与Frosch所测序列的同源性只有38%，说明AgB最小亚基并非单一蛋白，不同株间具相关性但存在差异。利用多株8 ku重组蛋白单克隆抗体研究抗原位点发现，大多数McAb与其编码的肽的N端结合，也有与C端RGLIAEGE序列反应的。在AgB其它亚基亦有类似的抗原位点。Leggatt等[6]利用抗原B 亚单位重组蛋白研究抗原位点，并用于检测病人血清，结果能检出67%包虫病患者阳性血清。
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本研究利用RT-PCR首次扩增出中国新疆羊源E.granulosus抗原B 亚单位前体蛋白基因，并进行了序列测定和同源性比较，结果表明不同地理株之间存在差异。该基因的克隆和抗原位点分布及免疫应用等研究结果将另文发表。
基金项目：中国博士后基金资助项目(1999[17]号)
作者简介：陆家海(1964-)，男，河南济源人，博士后.
参考文献：
[1] 王全中，崔 晶，晋雪香，等.河南省包虫病的流行病学特征[J].地方病通报，1996，11(1)：42.
[2] Rickard M D,Honey R, Brumley J L, et al. Serological diagnosis and post-operative surveillance of human hydatid disease.Ⅱ.The enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) using various antigens [J].Pathology,1984,16:211.
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[3] Fernandez V, Ferreira H B, Fernandez C, et al.Molecular characterisation of a novel 8-kDa subunit of Echinococcus granulosus antigen B [J].Mol Biochem Parasitol 1996,77(2):247.
[4] Leggatt G R,Yang W,McManus D P. Serological evalution of the 12 kDa subunit of antigen B in Echinococcus granulosus cyst fluid by immunoblot analysis [J].Trans R Soc Trop Med Hyg,1992,86(2):189.
[5] Frosch P ,Hartmann M, Muhlschiegel F, et al. Sequence heterogeneity of echinococcal antigen B [J].Mol Biochem Parasitol, 1994，64：171.
[6] Leggatt G R ,McManus D P. Identification and diagnostic value of a major antibody epitope on the 12 kDa antigen from Echinococuus granulosus (hydatid disease)cyst fluid [J].Parasite Immunol,1994,16(2):87.
收稿日期：2000-05-15, 百拇医药
单位：陆家海(中山医科大学 寄生虫学教研室)；余新炳(中山医科大学 寄生虫学教研室)；高劲松(中山医科大学 达安基因诊断中心)；单志新(中山医科大学 寄生虫学教研室)；陈慧红(中山医科大学 寄生虫学教研室)；郭中敏(中山医科大学 实验动物中心， 广东 广州 510089)
关键词：
00zk08摘 要：【目的】 获得细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列,并进行序列分析。【方法】 从包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节，使用TRIZOL试剂提取总RNA，逆转录成cDNA。根据E.granulosus抗原B亚单位基因的已知序列设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增出抗原B亚单位基因；将PCR产物纯化后用双脱氧链末端终止法进行序列测定，并进行序列分析。【结果】 用RT-PCR成功扩增出细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列，测序表明该基因ORF为270 bp,和已发表基因核苷酸序列相比，缺失3个碱基,同源性为84.2%，推导编码氨基酸序列同源性为77.8%。【结论】 从E.granulosus cDNA扩增出抗原B亚单位基因，该基因编码8 ku亚单位前体蛋白。
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中图分类号： R383.3 文献标识码： A
文章编号： 100-257X(2000)04S0-0027-03
Amplify and Sequence the Antigen B Subunit Gene from Echinococcus granulosus
LU Jia-hai, YU Xin-bing, SHAN Zhi-xin, CHEN Hui-hong
( Department of Parasitology)
GAO Jin-song
(Da′an Gene Diagnostic center)
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GUO Zhong-min
(Medical Laboratory Animal Center,Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)
Abstract：【Objective】 To obtain and analyze the sequence of cDNA of Echinococcusgranulosus antigen B subunit gene. 【Method】 Total RNA was extracted from protoscoles of cysts from ovine origin by using TRIZOL Reagents. The specific primers were designed according to published nucleotide sequence in the GenBank database. The Echinococcus granulosus cDNA was amplified by RT-PCR. The purified product of PCR was sequenced by the dideoxy chain termination method, and sequence analyses was performed by using standard computer program. 【Results】 A cDNA sequence with an open reading frame of 270 bp has been amplified successfully by using RT-PCR. Comparison of the DNA sequence and amino acid sequence deduced from cDNA with the published 8 ku subunit sequence of Echinococcus granulosus antigen B in the GenBank revealed lack of three bases and 84.27% and 77.8% identity respectively. 【Conclusion】 Ag B subunit gene has been isolated from cDNA of E.granulosus, this gene encodes a 8 ku subunit precursory protein.
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Key words: Echinococcus granulosus; Antigen B; gene amplication; sequence analysis
在全世界牧区，包虫病仍是一个严重的公共卫生问题。该病在中东、南欧、拉丁美洲、中亚、澳大利亚、和非洲部分国家流行，在我国以甘肃、新疆、宁夏、内蒙、青海等省(区)流行严重。随着现代社会的发展，人口流动增加，宠物(犬)和经济动物(狐狸)养殖数量增加，导致包虫病蔓延扩散，很多省(区)均发现包虫病人[1]。对于人的包虫病，往往在以下情况下才被发现：寄生在身体各器官的包囊增大到一定程度而引起功能障碍时，包囊遭到创伤性破裂而引起过敏现象或体检时进行物理检查(如X射线扫描等)。尽管物理诊断如超声扫描、CT断层分析有助于确定包囊的位置大小、包囊液充盈度、是否钙化，但对它们的性质往往难以作出精确判断。因而，特异性的血清学诊断就显得尤为重要。几乎所有的试验都曾用于包虫病的诊断。但是由于诊断包虫病的抗原因其特异性差或敏感性低而使其受到限制。因此，研究者试图来寻找一种特异、敏感的抗原。目前最常用的血清学诊断抗原是包囊液，但粗制的包囊液抗原对囊虫感染有严重的交叉反应，尽管用盐析技术分离包囊液抗原提高了敏感性，但非特异反应增多。用亲和层析法对抗原进一步纯化，增加了特异性，但敏感性降低[2]。研究表明，包囊液中有2种脂蛋白抗原(即抗原5和抗原B)，是具有十分特异的包虫病诊断抗原。通常用肝素亲和层析法来分离包囊液中的抗原5和抗原B，用于包虫病的诊断，具有很高的敏感性和特异性。然而由于制备这些抗原需要长期不断提供包囊液，同时用包囊液进行纯化抗原要求条件高，且因宿主自身抗原的存在而出现假阳性结果。理论上，重组抗原有助于解决上述弊端。基于此，本研究根据抗原B基因的发表序列，从我国新疆包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节，分离RNA，采用RT-PCR扩增抗原B亚单位前体蛋白基因，并进行测序鉴定，为进一步克隆表达和实际应用奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 细粒棘球蚴原头节的收集
从乌鲁木齐四桥屠宰场屠宰的包虫病羊，获取含包囊的肝脏，无菌条件下完整获取包囊，抽取包囊液，分离原头节，经PBS(pH 7.2)两次洗涤后，镜下观察其活力，然后放入液氮中保存备用。
1.2 主要酶类和其它试剂
Taq DNA聚合酶(5×106 U/L)，dNTP购自TakaRa公司，TRIZOL试剂，MMLV逆转录酶购自Gibco BRL公司。PCR系列试剂购自大连宝生物公司。
1.3 PCR引物
根据已报道的细粒棘球蚴抗原B亚单位前体蛋白基因cDNA序列经pcGENE软件分析设计引物[3]：引物1：5′-GCGTCGACATGAGGACTTACA-TCCTTCTCTC-3′，对应于抗原B的开放读框(ORF)41～63 bp；引物2：5′-GCCTCGAGTT-ACTTTGAATCATCATCTTTTTC-3′，对应于E.granulosus抗原B ORF中的289～313 bp。在两条引物加上保护性碱基GC，为了便于PCR产物的克隆，在引物1和引物2的两端分别引入一个SalⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物由大连宝生物公司合成。
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1.2 方 法
1.2.1 E.granulosus原头节总RNA的提取 取新鲜或液氮中冻存的E.granulosus原头节100 mg,使用TRIZOL(LIFE TECHNOLOGIES)试剂抽提总RNA，紫外分光光度计测定其含量，琼脂糖电泳鉴定其纯度。
1.2.2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 其组成和反应条件：5×RT Buffer 2 μL,10 mmol dNTP 1 μL,MMLV 1 μL,RNA 5 μL, Oligo(dT)1 μL，37 ℃ 1 h,95 ℃ 3 min。然后进行PCR，其组成和反应条件为：5×PCR Buffer 5 μL,2 mmol dNTP 2.5 μL,Tag 酶0.5 μL,引物1和引物2各1 μL,cDNA 1 μL, H2O 14 μL。94 ℃ 3 min,85 ℃ 30 s;93 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min,10 个循环;93 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30个循环。
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1.2.3 PCR产物的纯化、鉴定和序列测定 将PCR产物进行琼脂糖电泳，鉴定其大小是否与预期基因片段大小相符；然后将PCR产物纯化后，用上述引物(P1和P2)为测序引物，采用Sanger双脱氧链末端终止法，在ABI-373A自动测序仪上阅读碱基序列，对测序结果进行序列分析和同源性比较。
2 结 果
2.1 E.granulosus原头节RNA提取
按TRIZOL试剂抽提总RNA，紫外测定核酸含量为0.336 g/L,A260/A280=2.1,用1 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，RNA有2条带。
2.2 PCR产物的电泳鉴定
将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，扩增出符合预期大小(270 bp)的片段(图1)。
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图1 抗原B PCR产物电泳
Fig.1 Agarose electrophorosis analysis
of Antigen B PCR products
2.3 序列测定和同源性比较
从E.granulosus原头节提取RNA，依据抗原B亚单位前体基因序列设计的引物，利用RT-PCR扩增出抗原B亚单位前体基因，经序列测定和同源性比较和已发表序列的同源性为84.2%(碱基序列和推导的氨基酸序列如图2)。已发表基因ORF为273 bp,编码8 ku亚单位前体蛋白。该序列和已报告基因序列相比，缺失3个碱基(图3)。推导的氨基酸序列同源性为77.8%，和已报告的氨基酸序列相比，在36位置缺失一个氨基酸(图4)。
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图2 抗原B亚基核苷酸序列和推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid
sequence of E.granulosus Ag B subunit
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图3 抗原B核苷酸同源性比较
Fig.3 Comparision of homology with other
E.granulosus Ag B variants
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图4 氨基酸同源性比较
Fig.4 Homology is the same with the other
E.granulosus variants
Alignment of Seq 1 the amino sequence derived from RT-PCR and Seq 2 one of the published sequences of the 8 ku subunit of Ag B [3]
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3 讨 论
抗原5(Ag5)和抗原B(AgB)是两个公认的细粒棘球蚴特异抗原蛋白。曾认为Ag5在细粒棘球绦虫血清学反应中具有特异性抗原，但后来试验发现其与多房棘球蚴、囊虫和某些肠道线虫有交叉反应。AgB亦是公认的具有诊断价值的寄生虫蛋白，免疫印迹显示其最小亚基(12 ku/8 ku)可用于包虫病患者血清抗体的检测[4]。Frosch等进行了8 ku亚基的序列测定和同源性比较，显示不同地理来源的E.granulosus分离株在几个特定位置上的氨基酸种类有变动[5]。本研究扩增新疆羊源E.granulosus抗原B 8 ku亚基序列，和Frosch等所测序列的同源性为84.2%，所推导氨基酸同源性为77.8%，且在36位置缺失一个氨基酸。Fernandez等[3]分离得到8 ku亚单位cDNA克隆，其序列与Frosch所测序列的同源性只有38%，说明AgB最小亚基并非单一蛋白，不同株间具相关性但存在差异。利用多株8 ku重组蛋白单克隆抗体研究抗原位点发现，大多数McAb与其编码的肽的N端结合，也有与C端RGLIAEGE序列反应的。在AgB其它亚基亦有类似的抗原位点。Leggatt等[6]利用抗原B 亚单位重组蛋白研究抗原位点，并用于检测病人血清，结果能检出67%包虫病患者阳性血清。
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本研究利用RT-PCR首次扩增出中国新疆羊源E.granulosus抗原B 亚单位前体蛋白基因，并进行了序列测定和同源性比较，结果表明不同地理株之间存在差异。该基因的克隆和抗原位点分布及免疫应用等研究结果将另文发表。
基金项目：中国博士后基金资助项目(1999[17]号)
作者简介：陆家海(1964-)，男，河南济源人，博士后.
参考文献：
[1] 王全中，崔 晶，晋雪香，等.河南省包虫病的流行病学特征[J].地方病通报，1996，11(1)：42.
[2] Rickard M D,Honey R, Brumley J L, et al. Serological diagnosis and post-operative surveillance of human hydatid disease.Ⅱ.The enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) using various antigens [J].Pathology,1984,16:211.
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[3] Fernandez V, Ferreira H B, Fernandez C, et al.Molecular characterisation of a novel 8-kDa subunit of Echinococcus granulosus antigen B [J].Mol Biochem Parasitol 1996,77(2):247.
[4] Leggatt G R,Yang W,McManus D P. Serological evalution of the 12 kDa subunit of antigen B in Echinococcus granulosus cyst fluid by immunoblot analysis [J].Trans R Soc Trop Med Hyg,1992,86(2):189.
[5] Frosch P ,Hartmann M, Muhlschiegel F, et al. Sequence heterogeneity of echinococcal antigen B [J].Mol Biochem Parasitol, 1994，64：171.
[6] Leggatt G R ,McManus D P. Identification and diagnostic value of a major antibody epitope on the 12 kDa antigen from Echinococuus granulosus (hydatid disease)cyst fluid [J].Parasite Immunol,1994,16(2):87.
收稿日期：2000-05-15, 百拇医药