肌肉注射质粒DNA对蟾蜍骨骼肌单收缩力及强直收缩力的影响
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作者：许继田 赵文 涂会引 姚运纬 伍忍 汤健 唐朝枢
单位：许继田 赵文 涂会引 姚运纬 伍忍 汤健(河南医科大学生理教研室，郑州 450052)；唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所，北京 100034)
关键词：
中国应用生理学杂志000427
DNA结合蛋白不仅存在于细胞核内，hagstrom及本实验室分别在家兔及大鼠发现骨骼肌肌质 网(SR)膜上也存在DNA结合蛋白质，质粒DNA与SR上DNA结合蛋白结合之后，明显影响SR功能 ，促进SR Ca2+转运，即Ca2+摄入及释放均增加。 骨骼肌SR主要参与肌肉兴奋收缩耦联及维持肌细胞胞浆钙离子稳态，外源质粒DNA进入骨骼 肌细胞后是否可以通过SR上DNA结合蛋白改变SR功能，并进一步影响肌肉收缩活动尚不清楚 。本实验应用蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本，观察肌肉注射质粒DNA对肌肉收缩功能的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
(1)实验动物 选用健康活泼蟾蜍，体重20～30 g，随机分组，每组5～6只。
(2)质粒DNA的制备 质粒pcDNA3，购自invitrogen公司。质粒pcDNA3/ANF为本室构建，即 在pcDNA3的多克隆位点插入心钠素(ANF)全长cDNA，质粒经转化大肠杆菌进行扩增，应用聚 乙二醇纯化，获得闭合环状DNA，贮存于-20℃备用。
(3)蟾蜍腓肠肌直接基因转移 取40 μl(1 μg/μl)pcDNA3或pcDNA3/ANF用微量注射器沿蟾 蜍右后肢腓肠肌纵轴缓慢注入肌肉组织中，对侧肢体注射等量的任氏液(mmol/L)(NaCl 120 ,KCl 1.9,CaCl2 1.1，NaHCO3 2.4,NaH2PO4 0.083,葡萄糖 110作为对照，并分别 于1、2、4、8、24及48 h处死动物，制备坐骨神经腓肠肌标本，记录肌肉的单收缩和强直收 缩曲线。
, 百拇医药
(4)蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本制备 破坏脑和脊髓，按生理常规方法制备坐骨神经腓肠肌标 本。用锌铜弓轻触坐骨神经，如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，则表明标本的兴奋性良好， 将标本放在盛有任氏液的培养皿中备用。
(5)蟾蜍骨骼肌单收缩和强直收缩测定 将制备好的标本置于任氏液中浸泡5～10 min，而后 将标本固定于肌动器，并与机械-电换能器相连，使肌肉处于自然拉长的长度。按照biolap 98软件操作程序，通过电脑记录腓肠肌的单收缩及强直收缩曲线。单收缩刺激频率1 Hz，刺 激强度为2 V，强直收缩刺激频率为20 Hz，刺激强度为2 V。
(6)统计学处理 所有数据均用均数±标准差(
±s)表示，两样本显著性比较用 t检验。
2 结果
, 百拇医药 (1)质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对蟾蜍骨骼肌单收缩力的影响 质粒poDNA3腓肠肌内直接注射 之后，1 h、2 h及4 h肌肉单收缩力(42.1±3.68g、36.0±9.3g、22.8±4.1 g)均明 显低于对照组(61.9±2.6 g、46.2±5.9 g、42.0±14.2 g)(P<0.01), 8 h 、24 h及48 h肌肉单收缩力(62.0±5.7 g、85.3±2.4 g、57.9±5.4 g)均明显升高 ，分别为对照组(38.5±8.9 g、40.5±5.4 g、50.3±1.6 g)的161%、210%及115%( P<0.01)；应用质粒pcDNA3/ANF腓肠肌内直接注射之后，1 h及2 h肌肉单收缩力(54.3±4 .1 g、20.7±5.5 g)均明显低于对照组(63.9±2.1 g、47.8±13.1 g)(P<0.01) ,4 h组对照(43.0±13.3 g)及实验(50.5±9.6 g)无差别，8 h、24 h及48 h肌肉单收缩 力(60.4±1.5 g、59.2±5.6 g、58.0±2.1 g)均明显升高，分别为对照组(46.0±1 .5 g、41.8±10.1 g、51.3±1.0 g)的131%、141%及113%(P<0.01)，提示在质粒D NA转染入肌细胞的过程中肌肉的单收缩力呈现先降低后升高的趋势。
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(2)质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对蟾蜍骨骼肌强直收缩力的影响 质粒pcDNA3腓肠肌内直接注 射之后，1 h、2 h及4 h肌肉强直收缩力(174.6±9.3 g、167.4±5.7 g、152.4±5.4 g)均明显低于对照组(205.0±3.6 g、288.4±4.1 g、212.0±2.4 g)(P<0.01) ，8 h、24 h及48 h肌肉强直收缩力(275.8±5.7 g、219.6±9.2 g、250.3±7.5 g) 均明显升高，分别为对照组(197.6±8.2 g、206.4±7.7 g、196.8±3.5 g)的139%、 106%及127%(P<0.01)；应用质粒pcDNA3/ANF腓肠肌内直接注射之后，1 h、及2 h肌肉强 直收缩力(193.2±5.5 g、189.4±3.7 g)均明显低于对照组(207.0±0.9 g、211.4 ±6.1 g)(P<0.01)，4 h组对照(222.2±1.8 g)及实验(227.0±15.7 g)无差别。8 h、24 h及48 h肌肉强直收缩力(239.8±3.3 g、256.7±2.8 g、260.4±10.5 g)均 明显升高，分别为对照组(196.2±2.0 g、230.6±15.7 g、194.7±5.2 g)的122%、1 11%及134%(P<0.01)。提示在质粒DNA转染入肌细胞的过程中肌肉的强直收缩力也呈现先 降低后升高的趋势。
, 百拇医药
3 讨论
Hagstrom等及本实验室发现家兔及大鼠骨骼肌SR上存在DNA结合蛋白，质粒DNA与SR上DNA结 合蛋白结合之后，可明显促进SR对Ca2+的摄入与释放；本工作用直接肌肉注射法，将 质粒DNA转染入肌细胞之后，骨骼肌的单收缩力及强直收缩力均呈现先降低而后升高的趋势 ，提示在质粒DNA转染入肌细胞的过程中肌肉的收缩能力受到明显的影响。实验随机选用pcD NA3作为空载体代表，pcDNA3/ANF作为嵌合质粒的代表，结果显示两种质粒作用相似，无本 质差别，即这可能是一种质粒DNA转染过程中的普遍现象。
Ca2+是肌肉兴奋-收缩耦联时的重要耦联物质，SR对Ca2+的摄入及释放起关键 性作用， SR Ca2+的摄入及释放能力增强将会显著增强肌肉收缩力。本实验结果发 现将裸露的质粒DNA注入肌肉之后，肌肉的单收缩力及强直收缩力均出现先降低后升高的趋 势，收缩力的降低可能是由于在肌肉摄取裸露的质粒DNA的过程中最初几小时(8 h以内)是需 要消耗能量的，从而导致供给肌肉收缩的ATP量的减少，肌肉收缩的幅度降低。这与文献报 道肌肉注射质粒DNA之后 8 h 质粒DNA转染达高峰相一致。转染入肌细胞的质粒DNA大多数集 中于SR囊泡内，因此肌肉注射质粒DNA 8 h之后肌肉收缩力的升高可能是由于转染入肌细胞 的质粒DNA与SR上DNA结合蛋白的结合从而引起SR对Ca2+的摄入及释放能力增加所致。
骨骼肌因其独特的结构特征以及容量大、血流量丰富等优势，被用于作为直接基因转移并进 行基因治疗的靶器官，外源的质粒DNA转染入肌细胞后，除了表达目的基因外，还可与SR上 的DNA结合蛋白结合，增加其对Ca2+的摄入及释放能力，同时影响骨骼肌的肌肉收缩 力，外源DNA的这些非目的基因表达的生物学作用，值得高度重视并进行深入的探讨。
收稿日期：1999-03-25
修回日期：2000-01-18, 百拇医药
单位：许继田 赵文 涂会引 姚运纬 伍忍 汤健(河南医科大学生理教研室，郑州 450052)；唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管研究所，北京 100034)
关键词：
中国应用生理学杂志000427
DNA结合蛋白不仅存在于细胞核内，hagstrom及本实验室分别在家兔及大鼠发现骨骼肌肌质 网(SR)膜上也存在DNA结合蛋白质，质粒DNA与SR上DNA结合蛋白结合之后，明显影响SR功能 ，促进SR Ca2+转运，即Ca2+摄入及释放均增加。 骨骼肌SR主要参与肌肉兴奋收缩耦联及维持肌细胞胞浆钙离子稳态，外源质粒DNA进入骨骼 肌细胞后是否可以通过SR上DNA结合蛋白改变SR功能，并进一步影响肌肉收缩活动尚不清楚 。本实验应用蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本，观察肌肉注射质粒DNA对肌肉收缩功能的影响。
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1 材料与方法
(1)实验动物 选用健康活泼蟾蜍，体重20～30 g，随机分组，每组5～6只。
(2)质粒DNA的制备 质粒pcDNA3，购自invitrogen公司。质粒pcDNA3/ANF为本室构建，即 在pcDNA3的多克隆位点插入心钠素(ANF)全长cDNA，质粒经转化大肠杆菌进行扩增，应用聚 乙二醇纯化，获得闭合环状DNA，贮存于-20℃备用。
(3)蟾蜍腓肠肌直接基因转移 取40 μl(1 μg/μl)pcDNA3或pcDNA3/ANF用微量注射器沿蟾 蜍右后肢腓肠肌纵轴缓慢注入肌肉组织中，对侧肢体注射等量的任氏液(mmol/L)(NaCl 120 ,KCl 1.9,CaCl2 1.1，NaHCO3 2.4,NaH2PO4 0.083,葡萄糖 110作为对照，并分别 于1、2、4、8、24及48 h处死动物，制备坐骨神经腓肠肌标本，记录肌肉的单收缩和强直收 缩曲线。
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(4)蟾蜍坐骨神经腓肠肌标本制备 破坏脑和脊髓，按生理常规方法制备坐骨神经腓肠肌标 本。用锌铜弓轻触坐骨神经，如腓肠肌发生迅速而明显的收缩，则表明标本的兴奋性良好， 将标本放在盛有任氏液的培养皿中备用。
(5)蟾蜍骨骼肌单收缩和强直收缩测定 将制备好的标本置于任氏液中浸泡5～10 min，而后 将标本固定于肌动器，并与机械-电换能器相连，使肌肉处于自然拉长的长度。按照biolap 98软件操作程序，通过电脑记录腓肠肌的单收缩及强直收缩曲线。单收缩刺激频率1 Hz，刺 激强度为2 V，强直收缩刺激频率为20 Hz，刺激强度为2 V。
(6)统计学处理 所有数据均用均数±标准差(
±s)表示，两样本显著性比较用 t检验。2 结果
, 百拇医药 (1)质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对蟾蜍骨骼肌单收缩力的影响 质粒poDNA3腓肠肌内直接注射 之后，1 h、2 h及4 h肌肉单收缩力(42.1±3.68g、36.0±9.3g、22.8±4.1 g)均明 显低于对照组(61.9±2.6 g、46.2±5.9 g、42.0±14.2 g)(P<0.01), 8 h 、24 h及48 h肌肉单收缩力(62.0±5.7 g、85.3±2.4 g、57.9±5.4 g)均明显升高 ，分别为对照组(38.5±8.9 g、40.5±5.4 g、50.3±1.6 g)的161%、210%及115%( P<0.01)；应用质粒pcDNA3/ANF腓肠肌内直接注射之后，1 h及2 h肌肉单收缩力(54.3±4 .1 g、20.7±5.5 g)均明显低于对照组(63.9±2.1 g、47.8±13.1 g)(P<0.01) ,4 h组对照(43.0±13.3 g)及实验(50.5±9.6 g)无差别，8 h、24 h及48 h肌肉单收缩 力(60.4±1.5 g、59.2±5.6 g、58.0±2.1 g)均明显升高，分别为对照组(46.0±1 .5 g、41.8±10.1 g、51.3±1.0 g)的131%、141%及113%(P<0.01)，提示在质粒D NA转染入肌细胞的过程中肌肉的单收缩力呈现先降低后升高的趋势。
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(2)质粒pcDNA3及pcDNA3/ANF对蟾蜍骨骼肌强直收缩力的影响 质粒pcDNA3腓肠肌内直接注 射之后，1 h、2 h及4 h肌肉强直收缩力(174.6±9.3 g、167.4±5.7 g、152.4±5.4 g)均明显低于对照组(205.0±3.6 g、288.4±4.1 g、212.0±2.4 g)(P<0.01) ，8 h、24 h及48 h肌肉强直收缩力(275.8±5.7 g、219.6±9.2 g、250.3±7.5 g) 均明显升高，分别为对照组(197.6±8.2 g、206.4±7.7 g、196.8±3.5 g)的139%、 106%及127%(P<0.01)；应用质粒pcDNA3/ANF腓肠肌内直接注射之后，1 h、及2 h肌肉强 直收缩力(193.2±5.5 g、189.4±3.7 g)均明显低于对照组(207.0±0.9 g、211.4 ±6.1 g)(P<0.01)，4 h组对照(222.2±1.8 g)及实验(227.0±15.7 g)无差别。8 h、24 h及48 h肌肉强直收缩力(239.8±3.3 g、256.7±2.8 g、260.4±10.5 g)均 明显升高，分别为对照组(196.2±2.0 g、230.6±15.7 g、194.7±5.2 g)的122%、1 11%及134%(P<0.01)。提示在质粒DNA转染入肌细胞的过程中肌肉的强直收缩力也呈现先 降低后升高的趋势。
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3 讨论
Hagstrom等及本实验室发现家兔及大鼠骨骼肌SR上存在DNA结合蛋白，质粒DNA与SR上DNA结 合蛋白结合之后，可明显促进SR对Ca2+的摄入与释放；本工作用直接肌肉注射法，将 质粒DNA转染入肌细胞之后，骨骼肌的单收缩力及强直收缩力均呈现先降低而后升高的趋势 ，提示在质粒DNA转染入肌细胞的过程中肌肉的收缩能力受到明显的影响。实验随机选用pcD NA3作为空载体代表，pcDNA3/ANF作为嵌合质粒的代表，结果显示两种质粒作用相似，无本 质差别，即这可能是一种质粒DNA转染过程中的普遍现象。
Ca2+是肌肉兴奋-收缩耦联时的重要耦联物质，SR对Ca2+的摄入及释放起关键 性作用， SR Ca2+的摄入及释放能力增强将会显著增强肌肉收缩力。本实验结果发 现将裸露的质粒DNA注入肌肉之后，肌肉的单收缩力及强直收缩力均出现先降低后升高的趋 势，收缩力的降低可能是由于在肌肉摄取裸露的质粒DNA的过程中最初几小时(8 h以内)是需 要消耗能量的，从而导致供给肌肉收缩的ATP量的减少，肌肉收缩的幅度降低。这与文献报 道肌肉注射质粒DNA之后 8 h 质粒DNA转染达高峰相一致。转染入肌细胞的质粒DNA大多数集 中于SR囊泡内，因此肌肉注射质粒DNA 8 h之后肌肉收缩力的升高可能是由于转染入肌细胞 的质粒DNA与SR上DNA结合蛋白的结合从而引起SR对Ca2+的摄入及释放能力增加所致。
骨骼肌因其独特的结构特征以及容量大、血流量丰富等优势，被用于作为直接基因转移并进 行基因治疗的靶器官，外源的质粒DNA转染入肌细胞后，除了表达目的基因外，还可与SR上 的DNA结合蛋白结合，增加其对Ca2+的摄入及释放能力，同时影响骨骼肌的肌肉收缩 力，外源DNA的这些非目的基因表达的生物学作用，值得高度重视并进行深入的探讨。
收稿日期：1999-03-25
修回日期：2000-01-18, 百拇医药