靳松 彭建强 林昆 黄爱军 李亚杰

    力学刺激对软骨细胞的功能活动及骨的正常发育与成熟具有重要影响，而甲状旁腺激素相关肽(PTHrP) 在骺板软骨分化发育中起关键作用，在钙磷代谢、骨矿化等方面发挥生物学作用[1]。骺板软骨前体干细胞(PSC)是骺板周围软骨膜及静止区中存在的一类可以分裂增殖、自我更新的成体干细胞[2]。本研究采用动态压力细胞培养装置对体外培养的骺板软骨PSC予不同强度和持续时间的压力刺激，探讨其对PTHrP mRNA表达水平的影响及相互联系，并借助于蛋白质组学技术，寻找和发现动态压力作用下调控软骨细胞代谢和功能改变的特定的蛋白质分子，为动态压力作用下软骨改建机制的更深入研究提供依据。

    材料与方法

    一、实验动物

    健康新生24 h SD大鼠，SPF清洁级，雌雄不限，体质量(5.2±0.5)g，购自广东省医学实验动物中心，动物合格证编号为粤检证字2002A015号。

    二、主要试剂及仪器

    胎牛血清(Gibco公司，美国)，胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、琼脂糖(Sigma公司，美国)，DMEM/F12培养基(Hyclone公司，美国)，兔多克隆成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)抗体(SantaCruz公司，美国)，Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)，逆转录试剂盒(Toyobo公司，日本)， PCR试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)；miniMACS磁性细胞分选系统及相关试剂(Miltenyi公司，德国)，细胞培养箱(Forma公司，美国)，倒置相差显微镜(Nikon公司，日本)，荧光显微镜(OLYMPUS公司，日本)，PCR仪(Eppendorf公司，德国)，凝胶成像分析系统(Bio-RAD公司，美国)，可控动态细胞压力加载装置(由中山大学骨科研究所提供)。

    三、实验方法

    1.骺板软骨PSC的分离纯化及培养鉴定

    根据文献[3]的方法，以显微手术器械剪取股骨下端骺板两端的软骨膜组织充分剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶消化5 min后离心2 min，弃上清后用1.0 g/L Ⅱ型胶原酶37℃消化2 h，200目滤网过滤，离心8 min后收集细胞，调整密度后接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。采用miniMACS磁性细胞分选系统分离纯化PSC，原代细胞消化后通过单细胞滤器悬浮于Buffer溶液中，加入多克隆抗体FGFR-3，孵育15 min，离心洗涤后加入免疫磁珠室温孵育15 min ......