何广宁 吴永定 陈果 蔡志煅 曾彦茹 江福能

    523059东莞，南方医科大学附属东莞人民医院肿瘤外科(何广宁)；510180 广州，广州医科大学公共卫生学院(吴永定)；510180 广州，广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科 广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室(陈果，曾彦茹，江福能)；510515 广州，南方医科大学南方医院 广东省肾脏病研究所(蔡志煅)

    NEK2对前列腺癌细胞增殖的影响

    何广宁吴永定陈果蔡志煅曾彦茹江福能

    523059东莞，南方医科大学附属东莞人民医院肿瘤外科(何广宁)；510180 广州，广州医科大学公共卫生学院(吴永定)；510180 广州，广州医科大学附属广州市第一人民医院泌尿外科 广东省临床分子医学及分子诊断重点实验室(陈果，曾彦茹，江福能)；510515 广州，南方医科大学南方医院 广东省肾脏病研究所(蔡志煅)

    【摘要】目的探讨中心体相关激酶2(NEK2)在良性前列腺上皮细胞和前列腺癌细胞中的表达差异，及NEK2对前列腺癌细胞增殖的影响。方法运用荧光实时定量PCR检测NEK2在良性前列腺上皮细胞PrEC和前列腺癌细胞PC3、LNCaP和DU145中的表达情况，通过短发夹RNAs(shRNA)抑制LNCaP细胞株中内源性NEK2的表达，再利用细胞增殖实验及裸鼠肿瘤种植检测LNCaP增殖情况。结果前列腺癌细胞PC3、LNCaP和DU145中的NEK2表达水平均比良性前列腺上皮细胞PrEC增加(P均0.7的样本保存备用。

    2. 实时荧光定量PCR

    采用一步法实时荧光定量PCR(RT-PCR)，使用PC3、DU145、LNCaP及PREC mRNA的逆转录产物为模板，分别扩增目的基因，检测并验证NEK2 mRNA在前列腺癌细胞中的表达水平，所有数据分析采用美国Bio-Rad 公司的Opticon Monitor software 3.1版。

    3. 细胞株构建与验证

    按照试剂盒说明书用短发夹RNA(shRNA)转染LNCaP(shNEK2)。使用蛋白免疫印迹法验证NEK2蛋白表达强度：转染48 h后提取蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，然后将凝胶上的蛋白转移至膜上，封闭，加入抗体孵育后与发光液充分反应，曝光并将结果扫描后用图像分析系统处理，β-actin 用作内参对照。设PrEC为阴性对照、未转染的LNCaP为阳性对照、转染无关序列的LNCaP(Scrambled)为阴性对照。通过RT-PCR验证shNEK2及Scrambled的NEK2 mRNA表达水平 ......