邓伟明 廖泽涛 黄志祥 郭欣 李天旺

    强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞踝蛋白1表达的研究

    邓伟明廖泽涛黄志祥郭欣李天旺

    510317 广州，广东省第二人民医院风湿免疫科(邓伟明，黄志祥，郭欣，李天旺)；510630 广州，中山大学附属第三医院风湿免疫科(廖泽涛)

    【摘要】目的探讨强直性脊柱炎(AS)患者、类风湿关节炎(RA)患者及健康志愿者(HV)外周血单个核细胞(PBMC)中踝蛋白1的表达水平及其差异。方法采集AS、RA患者及HV外周血样本各30例，流式细胞术分析CD3+ T细胞及CD14+单核细胞中踝蛋白1蛋白平均荧光强度(MFI)，逆转录PCR(RT-PCR)检测PBMC中踝蛋白1 mRNA表达水平，比较组间踝蛋白1在蛋白及mRNA表达的差异。结果在CD3+ T细胞及CD14+单核细胞中，AS患者的踝蛋白1 MFI水平均高于HV和RA患者(P均0.05)。RT-PCR提示AS患者、HV及RA患者踝蛋白1 mRNA相对表达水平分别为1.37±0.22、0.26±0.05、0.27±0.06，AS患者的踝蛋白1 mRNA相对表达水平均高于HV和RA患者(P均5.1分；⑤近2月内无任何急性感染病史；⑥无其他慢性病病史。另纳入年龄20～40岁的30名HV(HV组)作对照。本研究经医院伦理委员会批准，所有入组的个体均为自愿参加试验，并于入选时签署知情同意书。

    二、标本采集

    对入组的每例个体，均以真空EDTA抗凝管(2 ml及4 ml各1管)于空腹状态经外周静脉采血6 ml，立刻置4℃冰箱保存备用。其中2 ml静脉血于6 h内进行免疫荧光染色处理并于当日进行FCM分析；4 ml静脉血于2 h内用于分离PBMC，并提取总RNA用于RT-PCR实验。

    三、方法

    1. 踝蛋白1的蛋白表达水平检测

    取依地酸二钠(EDTA)抗凝全血标本100 μl，分别加入PE anti-human CD14(美国BD Biosciences)、PE-CY5 anti-human CD3(美国BD Biosciences)各5 μl混匀，经过避光孵育及离心后，加入红细胞裂解液并离心，弃去上清后充分固定，在破膜之后加入踝蛋白 1抗体(美国Santa Cruz Biotechnology)，最后加入FITC标记的二抗(美国Santa Cruz Biotechnology)，避光孵育待测。以FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson)检测及分析PBMC(CD14+单核细胞及CD3+T细胞)中踝蛋白1的MFI值 ......