mmiR124靶向抑制NFATc1调控小鼠C3H10T1/2细胞软骨分化的研究(3)
在成软骨诱导分化第0、7、10、14日收集C3H10T1/2细胞微球，按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，并检测总RNA的含量及纯度，再按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，合成模板DNA第一链，实时定量PCR扩增目的基因，引物序列见表1。反应条件为95℃10 min，95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环，内参为18 s。一步加A法逆转录miR，反应条件为95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40个循环，内参为U6。上下游引物序列分别为5CTCGCTTCGGCAGCACA3和5AACGCTTCACGAATTTGCGT3，使用2ΔΔCt法计算基因相对表达量。每组实验重复3次，结果取平均值。记录软骨分化的相关标志基因Aggrecan、Ⅱ型胶原蛋白(Col2a1)和Ⅹ型胶原蛋白(Col10a1)及Sox9 mRNA表达水平。另外，取成软骨诱导7 d的C3H10T1/2细胞转染pNFATc1Wt质粒(Control组)、pNFATc1Wt质粒及miR124 mimics(miR124组)、经siRNA干预的pNFATc1Wt质粒(siNFATc1组) ......
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