EPC、FMD与脓毒症患者病情严重程度的相关性研究(1)
【摘要】目的探讨脓毒症患者外周血循环内皮祖细胞(EPC)数量及肱动脉内皮依赖性舒张功能(FMD)与病情严重程度的相关性。方法纳入脓毒症患者15例为脓毒症组，同期住院非脓毒症患者巧例为非脓毒症组，以Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，体外诱导分化EPC，利用ac-LDL及Lectin抗体荧光标记法进行双阳性计数;用彩色多普勒超声检查测定2组患者的FMD;以序贯器官功能衰竭估计(SOFA)评分评价患者病情严重程度。结果脓毒症组患者EPC数量较非脓毒症组少(33.9±7.7 vs.45.0±7.4，P<0.05)，FMD测定值较低[(6.3±1.2)%VS.(7.7±0.9)%，P<0.05]。EPC数量与FMD测定值呈正相关(rr=0.770，P<0.001);脓毒症组患者EPC数量与SOFA评分呈负相关(rs=-0.615、P<0.001)，FMD测定值与SOFA评分呈负相关(rs=-0.636、P=0.011)。结论脓毒症患者外周血循环EPC数量及FMD测定值或可作为评估脓毒症病情严重程度的指标。
【关键词】脓毒症;内皮祖细胞;肱动脉内皮依赖性舒张功能;序贯器官功能衰竭估计评分
脓毒症是因感染引起宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，是急诊科常见的危重症之一，发病率逐年升高，病死率高，救治困难[1-2]。机体发生脓毒症时，病原体通过炎症介质、细胞因子等介导而引发一系列的炎症反应，导致血管内皮损伤。血管内皮功能损伤，一方面，血管舒张、毛细血管渗漏、内皮肿胀等导致的炎性介质浸润造成组织、器官微循环障碍，引发缺血、缺氧;另一方面，内皮细胞直接参与免疫应答，引起机体免疫功能下降，组织、器官对抗病原体能力下降，造成器官损伤进一步加重[3-4]。内皮祖细胞(EPC)是近年来被发现的一类具有干细胞潜能的前体细胞，能够定向分化增殖形成成熟的血管内皮细胞，从而起到修复、再生血管作用。在心血管疾病、脑血管疾病、周围血管疾病及肿瘤血管新生研究中，均证实了EPC在维持和修复内皮细胞功能、血管新生中扮演重要角色[5]。肱动脉血流介导的内皮依赖性舒张功能(FMD)能反映内皮功能紊乱程度，FMD检测是一种无创、可重复的检测血管内皮功能的新技术[6]。在脓毒症发病机制中EPC数量和FMD变化及其作用机制迄今尚未明确。笔者通过测定脓毒症患者循环EPC数量和FMD，就其与脓毒症病情严重程度的相关性进行初步探讨。
对象与方法
一、研究对象
连续纳入2017年10月至2018年3月中山大学附属第一医院急诊科收治的脓毒症患者15例为脓毒症组，诊断标准参照2016年拯救脓毒症运动制定的脓毒症和脓毒症休克诊断指南(Sepsis 3.0)[1]。15例中男5例、女10例;同时抽取同期住院的非脓毒症患者15例作为非脓毒症组，其中男6例、女9例。所有患者均排除以下情况：①既往有高血压病、糖尿病、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中、肿瘤病史;②孕妇;③年龄小于18岁。2组患者基线资料见表1。本研究由中山大学附属第一医院伦理委员会批准，人组前所有患者或其家属均签署了知情同意书。
二、主要仪器与试剂
红细胞裂解液、淋巴细胞分离液购于中国碧云天公司，EBM-2培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清和0.25%胰酶购于美国Gibco公司，人纤维黏连蛋白购于康宁公司，磷酸盐缓冲液(PBS)、乙酞化低密度蛋白(ac-LDL)一抗和外源凝集素(Lectin)一抗购于美国Sigma公司，4%多聚甲醛购于雷根公司，日立彩色多普勒超声诊断仪(型号TJ454)。
三、分离外周血单个核细胞及培养EPC
抽取2组患者外周静脉血15ml，常温下保存于肝素抗凝管。3h内加入等体积PBS稀释，抽取混合稀释后的血液缓慢垂直加入等体积淋巴细胞分离液液面，常温离心，400g×30min、小心吸取中间的白膜层置于15ml离心管，经PBS 5ml洗涤2次，加入红细胞裂解液后充分裂解，常温离心，400g×10min。弃上清后加入EBM-2培养基，混合后均匀铺于人纤维蛋白包被的6孔细胞培养板，于5%二氧化碳、37℃培养箱常规培养。培养第4日换液，第7日置于倒置相差显微镜下观察细胞形态[7]。
四、细胞计数
细胞培养7d后取一部分贴壁细胞在10μg/L的ac-LDL溶液中孵育1h，之后用4%多聚甲醛固定，以10μg/L的Lectin抗体溶液孵育1h，并置于荧光显微镜下观察拍片，贴壁细胞吞噬ac-LDL荧光染色阳性为红色，Lectin抗体荧光染色阳性为绿色，双染色阳性即红色和绿色双染色细胞为EPC，计算EPC数量[7]。
五、计算脓毒症组与非脓毒症组患者序贯器官功能衰竭估计(SOFA)评分
记录2组患者循环血压、氧合指数、肌酐、胆红素、血小板计数及GCS评分，根据脓毒症和脓毒症休克诊断指南(Sepsis 3.0)进行SOFA评分川。
六、受试者胧动脉FMD测定值
使用日立彩色多普勒超声诊断仪分别测定2组安静状态下、反应性充血时肱动脉内径变化。于右臂肘上2～3cm处探测肱动脉，取其纵切面，调节增益直至前后壁内膜显示最清晰，同步在心电波形R波顶点处测量心室舒张末期时前后内膜间距作为血管基础内径。后行反应性充血试验，将血压计袖带缚于前臂肘關节下2～3cm处，充气加压至250mm Hg(1mm Hg=0.133kPa)，持续5min后迅速放气，于放气后1min内测量胧动脉内径。在测量过程中，超声探头始终固定于同一位置，测量同一处血管[8]。取3个心动周期的平均值，计算充血实验前后差值与基础内径比值。
七、统计学处理
采用SPSS 15.0分析数据。正态分布计量资料以x1s表示，2组间比较采用t检验;非正态分布计量资料用中位数(上、下四分位数)表示，组间比较用秩和检验。计数资料用率(百分比)表示，组间比较用Fisher确切概率法。相关性采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。, 百拇医药(陈伟栋 徐嘉 黄振华 古钎林 廖瑾莉 韦秋霞 詹红)
【关键词】脓毒症;内皮祖细胞;肱动脉内皮依赖性舒张功能;序贯器官功能衰竭估计评分
脓毒症是因感染引起宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，是急诊科常见的危重症之一，发病率逐年升高，病死率高，救治困难[1-2]。机体发生脓毒症时，病原体通过炎症介质、细胞因子等介导而引发一系列的炎症反应，导致血管内皮损伤。血管内皮功能损伤，一方面，血管舒张、毛细血管渗漏、内皮肿胀等导致的炎性介质浸润造成组织、器官微循环障碍，引发缺血、缺氧;另一方面，内皮细胞直接参与免疫应答，引起机体免疫功能下降，组织、器官对抗病原体能力下降，造成器官损伤进一步加重[3-4]。内皮祖细胞(EPC)是近年来被发现的一类具有干细胞潜能的前体细胞，能够定向分化增殖形成成熟的血管内皮细胞，从而起到修复、再生血管作用。在心血管疾病、脑血管疾病、周围血管疾病及肿瘤血管新生研究中，均证实了EPC在维持和修复内皮细胞功能、血管新生中扮演重要角色[5]。肱动脉血流介导的内皮依赖性舒张功能(FMD)能反映内皮功能紊乱程度，FMD检测是一种无创、可重复的检测血管内皮功能的新技术[6]。在脓毒症发病机制中EPC数量和FMD变化及其作用机制迄今尚未明确。笔者通过测定脓毒症患者循环EPC数量和FMD，就其与脓毒症病情严重程度的相关性进行初步探讨。
对象与方法
一、研究对象
连续纳入2017年10月至2018年3月中山大学附属第一医院急诊科收治的脓毒症患者15例为脓毒症组，诊断标准参照2016年拯救脓毒症运动制定的脓毒症和脓毒症休克诊断指南(Sepsis 3.0)[1]。15例中男5例、女10例;同时抽取同期住院的非脓毒症患者15例作为非脓毒症组，其中男6例、女9例。所有患者均排除以下情况：①既往有高血压病、糖尿病、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中、肿瘤病史;②孕妇;③年龄小于18岁。2组患者基线资料见表1。本研究由中山大学附属第一医院伦理委员会批准，人组前所有患者或其家属均签署了知情同意书。
二、主要仪器与试剂
红细胞裂解液、淋巴细胞分离液购于中国碧云天公司，EBM-2培养基、DMEM高糖培养基、胎牛血清和0.25%胰酶购于美国Gibco公司，人纤维黏连蛋白购于康宁公司，磷酸盐缓冲液(PBS)、乙酞化低密度蛋白(ac-LDL)一抗和外源凝集素(Lectin)一抗购于美国Sigma公司，4%多聚甲醛购于雷根公司，日立彩色多普勒超声诊断仪(型号TJ454)。
三、分离外周血单个核细胞及培养EPC
抽取2组患者外周静脉血15ml，常温下保存于肝素抗凝管。3h内加入等体积PBS稀释，抽取混合稀释后的血液缓慢垂直加入等体积淋巴细胞分离液液面，常温离心，400g×30min、小心吸取中间的白膜层置于15ml离心管，经PBS 5ml洗涤2次，加入红细胞裂解液后充分裂解，常温离心，400g×10min。弃上清后加入EBM-2培养基，混合后均匀铺于人纤维蛋白包被的6孔细胞培养板，于5%二氧化碳、37℃培养箱常规培养。培养第4日换液，第7日置于倒置相差显微镜下观察细胞形态[7]。
四、细胞计数
细胞培养7d后取一部分贴壁细胞在10μg/L的ac-LDL溶液中孵育1h，之后用4%多聚甲醛固定，以10μg/L的Lectin抗体溶液孵育1h，并置于荧光显微镜下观察拍片，贴壁细胞吞噬ac-LDL荧光染色阳性为红色，Lectin抗体荧光染色阳性为绿色，双染色阳性即红色和绿色双染色细胞为EPC，计算EPC数量[7]。
五、计算脓毒症组与非脓毒症组患者序贯器官功能衰竭估计(SOFA)评分
记录2组患者循环血压、氧合指数、肌酐、胆红素、血小板计数及GCS评分，根据脓毒症和脓毒症休克诊断指南(Sepsis 3.0)进行SOFA评分川。
六、受试者胧动脉FMD测定值
使用日立彩色多普勒超声诊断仪分别测定2组安静状态下、反应性充血时肱动脉内径变化。于右臂肘上2～3cm处探测肱动脉，取其纵切面，调节增益直至前后壁内膜显示最清晰，同步在心电波形R波顶点处测量心室舒张末期时前后内膜间距作为血管基础内径。后行反应性充血试验，将血压计袖带缚于前臂肘關节下2～3cm处，充气加压至250mm Hg(1mm Hg=0.133kPa)，持续5min后迅速放气，于放气后1min内测量胧动脉内径。在测量过程中，超声探头始终固定于同一位置，测量同一处血管[8]。取3个心动周期的平均值，计算充血实验前后差值与基础内径比值。
七、统计学处理
采用SPSS 15.0分析数据。正态分布计量资料以x1s表示，2组间比较采用t检验;非正态分布计量资料用中位数(上、下四分位数)表示，组间比较用秩和检验。计数资料用率(百分比)表示，组间比较用Fisher确切概率法。相关性采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。, 百拇医药(陈伟栋 徐嘉 黄振华 古钎林 廖瑾莉 韦秋霞 詹红)