曹素娟 刘书政 袁步奇 袁培乐 赵松鹤 张云芳

    血管钙化是慢性尿毒症患者发病和死亡的高危因素[1]。组织学上，血管钙化分为2 种类型，一种是与动脉粥样硬化相关的内膜钙化，表现为富含脂质的巨噬细胞浸润的内膜增生；另一种是中膜钙化，钙磷酸盐沉积于动脉中膜的平滑肌层，主要见于代谢相关疾病，如慢性尿毒症和糖尿病[2-3]。多项研究表明在慢性肾脏病患者中，高钙血症、甲状旁腺激素水平升高、炎症细胞因子、氧化应激、高磷血症等因素参与血管钙化[4-8]。近年研究表明，血管钙化是主动的、细胞介导调控的生物学进程，与软骨和骨形成类似，表现为血管平滑肌细胞伴随骨形成相关蛋白[Runt 相关转录因子2(RUNX2)、骨形态发生蛋白(BMP2)]的上调表达[9-10]。转录因子D 位点结合蛋白(DBP)属于脯氨酸和酸性氨基酸含量丰富的碱性亮氨酸拉链(PAR bZIP)转录因子家族成员，可结合靶基因启动子区特异的序列并激活转录调控生物昼夜节律[11]。DBP 是否参与尿毒症的调控尚未阐明，因此本研究对尿毒症血管钙化模型大鼠尾静脉注射小干扰DBP(shDBP)慢病毒，研究DBP 在抑制尿毒症血管钙化模型的作用及潜在机制。

    材料与方法

    一、材 料

    1. 实验动物

    24 只清洁级Sprague-Dawley 雄性大鼠，8 周龄，体质量180～220 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物的使用和处理过程均符合动物实验相关伦理规范。

    2. 主要试剂和仪器

    限制性内切酶AgeI、EcoRI 购于纽英伦生物技术(北京)有限公司；RUNX2、β-actin 抗体购于美国CST 中国公司。德国Eppendor 5920 R 高速低温离心机，中国粤显XJL-20/XJL-20BD 普通光学显微镜，美国Thermo HR1500-II 生物安全柜，美国伯乐小型水平电泳槽，海尔HCB-1300V 超净工作台。

    3. 短发夹RNA(shRNA)设计和构建

    参照已知GenBank 所示DBP mRNA 序列以及shRNA 的设计要求，设计并合成靶向DBP的特异性shRNA(shDBP)序列：正向5′-CCGG GAAGCCTCAGCCAATCATGAACTCGAGTTC ATGATTGGCTGAGGCTTC-3′ ......