电针对大鼠局灶脑缺血再灌注后脑内血管生长因子和血管抑制因子表达的影响(1)
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[摘要]目的：探讨电针对缺血性脑卒中的作用机制。方法：线栓法制备Wistar大鼠局灶脑缺血再灌注模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、电针组。选取双侧“合谷”穴为电针穴位，采用原位杂交法检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达，免疫组化法检测血管生成素(Ang-1)和内皮抑素(Endostatin)蛋白的表达。结果：模型组VEGF mRNA、Ang-1蛋白、Endostatin蛋白的表达较正常组增加(P1=40 Hz，F2=60 Hz，空载输出电压1.5 V。
1.4取材
每组动物到达相对应时相点时，大鼠麻醉后用生理盐水200 mL快速左心室灌注冲洗，再用4%多聚甲醛(加0.1%的DEPC)500 mL先快后慢灌注固定，断头取脑，制备石蜡切片，以缺血区周围为观察部位，取相邻切片分别用于原位杂交、免疫组化检测。
1.5 VEGF mRNA原位杂交检测
采用VEGF mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德公司)。杂交前处理：切片脱蜡至水，3%柠檬酸一胃蛋白酶液处理切片3 min，1%多聚甲醛(pH7.4的0.1 mol/L PBS配制，加0.1%的DEPC)后固定。杂交：滴加预杂交液，39℃预杂交6h，滴加适量的杂交液，盖上原位杂交盖玻片41℃过夜。杂交后洗涤：分别用2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC洗涤。依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛抗体、SABC、生物素化过氧化物酶。DAB显色、脱水、透明、封片。
1.6 Ang一1和Endostatin蛋白免疫组化检测
切片脱蜡至水，抗原热修复92～98℃15 min，滴加封闭液，分别滴加1：100兔抗大鼠Ang一1抗体(武汉博士德公司)和1：100兔抗大鼠Endosta—tin抗体(武汉博士德公司)，4℃过夜，滴加SABC。DAB显色、脱水、透明、封片。
1.7结果判定和统计学处理
阳性细胞计数：在×400视野下计数，以胞浆染成棕黄色为阳性细胞，每只动物随机选取3张非连续切片，每张切片取10个不连续视野的均值。每组数据用 ±s表示，用Excel软件进行t检验，以PO.05)，但再灌注后24 h观察到Ang-1蛋白升高(P
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