大鼠孤束核葡萄糖敏感神经元、胰岛素敏感神经元对耳甲电针的反应(1)
[摘要]目的：初步探讨耳针降糖作用的中枢机制。方法：微电极胞外记录孤束核(NTS)神经元活动，将记录的细胞随机分为颈静脉注射葡萄糖组、胰岛素组及耳甲电针组，观察上述处理因素对各组神经元放电活动的影响。结果：NTS存在葡萄糖敏感和胰岛素敏感神经元，葡萄糖敏感神经元中抑制型占37.3%，兴奋型占10.9%胰岛素敏感神经元中兴奋型占33.3%，抑制型占4.9%，电针耳甲，NTS神经元有49.3%(34/69)放电频率增加，4.3%(3/69)放电频率减少，34个耳针激活细胞中有18个对葡萄糖呈抑制反应，8个对胰岛素呈兴奋反应。结论：耳甲电针能兴奋NTS葡萄糖敏感神经元(抑制反应型为主)和胰岛素敏感神经元(激活反应型为主)，耳针的降糖效应可能与调节上述神经元放电活动有关。
[主题词]耳针；电针；孤束核/针灸效应，神经元/针灸效应；葡萄糖/针灸效应I@葡萄糖敏感神经元；@胰岛素敏感神经元
有资料显示，耳针具有较好地降低糖尿病患者血糖水平的作用，但其机制目前尚不清楚。血糖的正常水平维持受到胰岛素浓度的调节，而支配胰岛的迷走神经兴奋能够促进胰岛素的分泌。孤束核(NTS)是内脏感觉传人的重要中继站，接受来自内脏如胃肠、肝门以及胰岛等组织的迷走神经传人，通过汇聚整合再把与摄食相关的信号传入到前脑，如下丘脑外侧区等中枢核团，从而共同调节摄食行为，控制血糖。体外细胞研究显示大脑中枢除了下丘脑外还有其他核团存在葡萄糖敏感神经元，其中包括最后区(AP)、NTS以及迷走神经运动背核(DMV)E6n。胞外单细胞放电记录实验表明NTS尾部存在着较大比率(70%以上)的血糖敏感神经元，其中大部分神经元对葡萄糖浓度升高表现出放电频率增加，NTS的这些葡萄糖敏感神经元很可能参与了体内能量代谢和血糖调节；另一方面，有资料显示NTS还存在一些神经元对胰岛素水平敏感。研究表明NTS与耳甲部有神经纤维联系。笔者猜测针刺耳甲的信号很可能通过神经传人到达NTS，激活了上述NTS处血糖和胰岛素敏感神经元，通过耳一迷走一胰岛素(葡萄糖)完成体表与内脏的相关反射活动，维持正常血糖水平稳定。NTS是副交感神经初级传人神经元在中枢内集中投射的核团，是参与内脏一躯体反射的重要初级整合中枢，其是否还存在着葡萄糖、胰岛素敏感神经元?NTS处葡萄糖、胰岛素敏感神经元是否对电针刺激耳甲起反应?本实验旨在采用细胞外记录技术观察NTS的葡萄糖敏感神经元和胰岛素敏感神经元的活性特征，观察耳甲电针对NTS葡萄糖和(或)胰岛素敏感神经元放电活动的影响，初步探讨耳针降糖效应的中枢机制。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康成年的Sprague-Dawley雄性大鼠31只，清洁级，体重200～220 g，中国医学科学院实验动物研究所提供(合格证号：A06—055)。将探查到的NTS神经元随机分为葡萄糖输注组、胰岛素输注组以及耳甲电针组，每组神经元各140个，耳针刺激的部位为大鼠耳甲艇、耳甲腔内面相当于人耳穴的“肾”“胰腺”“肝胆”等穴点。耳针电极为一对自制银质圆形耳豆，形似王不留行籽，直径约2 mm。
1.2 实验步骤
(1)细胞外记录神经元放电手术过程
手术实验前配制15%葡萄糖、6 IU/mL胰岛素及生理盐水(o.9%)，0.5 tool/L醋酸钠溶液，2%滂胺天蓝溶液。用10%的氨基甲酸乙酯(乌拉坦)腹腔注射麻醉(1.O～1.2 g/kg)，手术及实验过程动物体温控制在(37+1)℃。大鼠麻醉后，动物俯卧，将大鼠头部用耳棒固定于立体定位仪头部固定器上，下齿挂在鼠头夹中，口鼻部用鼠头夹压紧。头顶部正中矢状线切口，暴露前后囟并调至同一水平。根据Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱，于NTS(距前囟：-11.3～-14.3 mm；中线旁开：O～2.3 mm；深度：4～7 ram)的颅骨表面，用牙科钻开颅，在显微镜下分层剥离硬脑膜和软脑膜，暴露脑组织并用温的石蜡油覆盖；同时对动物施行颈静脉插管手术，插管朝向头端，外接四通管，四通管连接自动推进微量注射器，分别注入事先配制的葡萄糖溶液、胰岛素溶液以及生理盐水。将手术后的大鼠头部用固定器固定在大鼠立体定位仪上，以玻璃微电极胞外记录NTS神经元对不同施加因素的放电频率变化情况，电极内充有2%滂胺天蓝溶液(电阻为10～20 MQ)。
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(2)施加不同处理因素
手术完成后，通过微电极操作控制器，于孤束核内上下探查神经元放电信号。当探查到孤束核细胞放电信号后，将细胞随机分为3组，分别按如下操作顺序施加因素：第1组，颈静脉输注葡萄糖(输注速度为O.25 mL/s)，观察孤束核细胞放电频率的变化，鉴别葡萄糖反应神经元的类型(放电频率升高、降低、不变)，如细胞放电频率发生变化，则待细胞恢复稳定放电频率状态，关闭四通管葡萄糖端，打开生理盐水端开关，输注生理盐水(输注速度同前)，继续观察细胞放电频率变化，如果所记录的神经元对生理盐水未发生放电频率变化(排除血压变化影响)，则认为是实验目标神经元，否则放弃统计(下同)。第2组，颈静脉输注胰岛素(输注速度同前)，观察孤束核细胞放电频率的变化，鉴别胰岛素反应神经元的类型(放电频率升高、降低、不变)，如细胞放电频率发生变化，则测试其对生理盐水是否发生放电频率变化，操作同前。若细胞放电活动对胰岛素输注敏感，则继续观察其对葡萄糖输注(浓度与推注速度同前)的放电频率变化情况。第3组，耳甲区穴位电针刺激(强度：2 mA，间隔：O.4 s，持续时间：O.4 ms)，每次刺激时段为30 s，自制耳豆电极连接于刺激器的正负两极，分别用胶布粘贴于耳甲部相邻的两穴(“肾”“胰腺”“肝胆”等)表皮，观察NTS神经元放电活动频率变化情况，若细胞放电频率发生明显变化，待细胞放电活动稳定后进一步分别监测输注葡萄糖及胰岛素对该细胞放电活动的影响，如果细胞放电活动发生反应，则待细胞放电活动稳定后继续输注生理盐水作对照。
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上述实验过程中，连续2个被测神经元间隔时间为20～40 min。细胞放电活动变化鉴别标准为：放电频率比施加因素前的基础放电频率(或稳定状态放电频率)升高或者降低30%以上，则认为神经元发生激活反应(活动兴奋)或神经元发生抑制反应(活动抑制)，否则定为放电频率无变化(活动无反应)。
(3)细胞记录部位的组织学定位
实验结束后，玻璃微电极通以10A的阴极电流20～30 min，泳出滂胺天蓝标记电极尖端位置，随后处死动物，取出含记录部位的大脑组织，用10%福尔马林溶液固定，3天后冰冻切片，染色，显微镜下观察，记录电极尖端所在位置，凡偏离NTS的结果舍弃不用。
1.3 数据采集及分析, 百拇医药
[主题词]耳针；电针；孤束核/针灸效应，神经元/针灸效应；葡萄糖/针灸效应I@葡萄糖敏感神经元；@胰岛素敏感神经元
有资料显示，耳针具有较好地降低糖尿病患者血糖水平的作用，但其机制目前尚不清楚。血糖的正常水平维持受到胰岛素浓度的调节，而支配胰岛的迷走神经兴奋能够促进胰岛素的分泌。孤束核(NTS)是内脏感觉传人的重要中继站，接受来自内脏如胃肠、肝门以及胰岛等组织的迷走神经传人，通过汇聚整合再把与摄食相关的信号传入到前脑，如下丘脑外侧区等中枢核团，从而共同调节摄食行为，控制血糖。体外细胞研究显示大脑中枢除了下丘脑外还有其他核团存在葡萄糖敏感神经元，其中包括最后区(AP)、NTS以及迷走神经运动背核(DMV)E6n。胞外单细胞放电记录实验表明NTS尾部存在着较大比率(70%以上)的血糖敏感神经元，其中大部分神经元对葡萄糖浓度升高表现出放电频率增加，NTS的这些葡萄糖敏感神经元很可能参与了体内能量代谢和血糖调节；另一方面，有资料显示NTS还存在一些神经元对胰岛素水平敏感。研究表明NTS与耳甲部有神经纤维联系。笔者猜测针刺耳甲的信号很可能通过神经传人到达NTS，激活了上述NTS处血糖和胰岛素敏感神经元，通过耳一迷走一胰岛素(葡萄糖)完成体表与内脏的相关反射活动，维持正常血糖水平稳定。NTS是副交感神经初级传人神经元在中枢内集中投射的核团，是参与内脏一躯体反射的重要初级整合中枢，其是否还存在着葡萄糖、胰岛素敏感神经元?NTS处葡萄糖、胰岛素敏感神经元是否对电针刺激耳甲起反应?本实验旨在采用细胞外记录技术观察NTS的葡萄糖敏感神经元和胰岛素敏感神经元的活性特征，观察耳甲电针对NTS葡萄糖和(或)胰岛素敏感神经元放电活动的影响，初步探讨耳针降糖效应的中枢机制。
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1.1 实验动物及分组
健康成年的Sprague-Dawley雄性大鼠31只，清洁级，体重200～220 g，中国医学科学院实验动物研究所提供(合格证号：A06—055)。将探查到的NTS神经元随机分为葡萄糖输注组、胰岛素输注组以及耳甲电针组，每组神经元各140个，耳针刺激的部位为大鼠耳甲艇、耳甲腔内面相当于人耳穴的“肾”“胰腺”“肝胆”等穴点。耳针电极为一对自制银质圆形耳豆，形似王不留行籽，直径约2 mm。
1.2 实验步骤
(1)细胞外记录神经元放电手术过程
手术实验前配制15%葡萄糖、6 IU/mL胰岛素及生理盐水(o.9%)，0.5 tool/L醋酸钠溶液，2%滂胺天蓝溶液。用10%的氨基甲酸乙酯(乌拉坦)腹腔注射麻醉(1.O～1.2 g/kg)，手术及实验过程动物体温控制在(37+1)℃。大鼠麻醉后，动物俯卧，将大鼠头部用耳棒固定于立体定位仪头部固定器上，下齿挂在鼠头夹中，口鼻部用鼠头夹压紧。头顶部正中矢状线切口，暴露前后囟并调至同一水平。根据Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱，于NTS(距前囟：-11.3～-14.3 mm；中线旁开：O～2.3 mm；深度：4～7 ram)的颅骨表面，用牙科钻开颅，在显微镜下分层剥离硬脑膜和软脑膜，暴露脑组织并用温的石蜡油覆盖；同时对动物施行颈静脉插管手术，插管朝向头端，外接四通管，四通管连接自动推进微量注射器，分别注入事先配制的葡萄糖溶液、胰岛素溶液以及生理盐水。将手术后的大鼠头部用固定器固定在大鼠立体定位仪上，以玻璃微电极胞外记录NTS神经元对不同施加因素的放电频率变化情况，电极内充有2%滂胺天蓝溶液(电阻为10～20 MQ)。
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(2)施加不同处理因素
手术完成后，通过微电极操作控制器，于孤束核内上下探查神经元放电信号。当探查到孤束核细胞放电信号后，将细胞随机分为3组，分别按如下操作顺序施加因素：第1组，颈静脉输注葡萄糖(输注速度为O.25 mL/s)，观察孤束核细胞放电频率的变化，鉴别葡萄糖反应神经元的类型(放电频率升高、降低、不变)，如细胞放电频率发生变化，则待细胞恢复稳定放电频率状态，关闭四通管葡萄糖端，打开生理盐水端开关，输注生理盐水(输注速度同前)，继续观察细胞放电频率变化，如果所记录的神经元对生理盐水未发生放电频率变化(排除血压变化影响)，则认为是实验目标神经元，否则放弃统计(下同)。第2组，颈静脉输注胰岛素(输注速度同前)，观察孤束核细胞放电频率的变化，鉴别胰岛素反应神经元的类型(放电频率升高、降低、不变)，如细胞放电频率发生变化，则测试其对生理盐水是否发生放电频率变化，操作同前。若细胞放电活动对胰岛素输注敏感，则继续观察其对葡萄糖输注(浓度与推注速度同前)的放电频率变化情况。第3组，耳甲区穴位电针刺激(强度：2 mA，间隔：O.4 s，持续时间：O.4 ms)，每次刺激时段为30 s，自制耳豆电极连接于刺激器的正负两极，分别用胶布粘贴于耳甲部相邻的两穴(“肾”“胰腺”“肝胆”等)表皮，观察NTS神经元放电活动频率变化情况，若细胞放电频率发生明显变化，待细胞放电活动稳定后进一步分别监测输注葡萄糖及胰岛素对该细胞放电活动的影响，如果细胞放电活动发生反应，则待细胞放电活动稳定后继续输注生理盐水作对照。
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上述实验过程中，连续2个被测神经元间隔时间为20～40 min。细胞放电活动变化鉴别标准为：放电频率比施加因素前的基础放电频率(或稳定状态放电频率)升高或者降低30%以上，则认为神经元发生激活反应(活动兴奋)或神经元发生抑制反应(活动抑制)，否则定为放电频率无变化(活动无反应)。
(3)细胞记录部位的组织学定位
实验结束后，玻璃微电极通以10A的阴极电流20～30 min，泳出滂胺天蓝标记电极尖端位置，随后处死动物，取出含记录部位的大脑组织，用10%福尔马林溶液固定，3天后冰冻切片，染色，显微镜下观察，记录电极尖端所在位置，凡偏离NTS的结果舍弃不用。
1.3 数据采集及分析, 百拇医药