糖尿病足不同证型血管细胞核增殖相关抗原(Ｋｉ67)表达差异研究
摘要 目的：探讨糖尿病足中医辨证分型与血管细胞核增殖相关抗原的表达差异。方法：对32例截肢的糖尿病足患者按中医辨证分为气血两虚瘀阻证、脉络瘀热证、脉络热毒证和气阴两虚瘀阻证，分别对其截肢肢体的胫后动脉应用免疫组化法对细胞核增殖相关抗原(Ki67)的表达进行观察、分析。结果：Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关，与血管炎症病变程度呈正相关。结论：炎症在糖尿症的大血管病变的过程中起到了重要的作用。
关键词 糖尿病足 中医证型 胫后动脉 血管细胞核增殖相关抗原 临床研究
糠尿病足是糖尿病的严重并发症，据统计1996年全球糖尿病患者1.2亿，预计到2025年，将达到2.5亿以上，而大约15%的糖尿病患者将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽[1]。目前对于糖尿病足病因及发病机制虽然还不是完全清楚，但大家公认糖尿病合并大血管病变导致动脉粥样硬化是糖尿病足发病的最主要因素。现将2004年10月～2005年5月间我们收治的32例糖尿病足患者的截肢动脉标本的血管细胞核增殖相关抗原(Ki67)与其中医辨证分型的相关性研究情况报告如下。
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1 临床资料
1.1 一般资料：32例均为天津医科大学代谢病医院和天津中医学院第一附属医院2004年10月～2005年5月间的住院患者，其中男性24例，女性8例；年龄50～86岁，平均年龄69.2岁；糖尿病病程最长30年，最短6年，平均18±2.4年。
1.2 诊断标准：糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学会第二届糖尿病足会议所制订的“糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。
1.3 截肢标准：参照国际糖尿病足工作组编写的《糖尿病足国际共识》中关于“大截肢的定义、标准和指标”[2]执行。
1.4 中医辨证分型标准：参照《中医外科学(第七版)》及《中药新药临床研究指导原则·脱疽》之中医辨证分型方案分为气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证、脉络热毒证四型。
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2 观察方法
2.1 标本取材：坏疽截肢标本32例，其中按中医辨证分型气血两虚瘀阻组10例，脉络瘀热组10例，气阴两虚瘀阻组4例，脉络热毒组8例，取各例标本下肢胫后动脉。标本经过10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，备用。
2.2 设备、试剂：美国PENGUIN-600CL自动图像分析系统，细胞核增殖相关抗原(Ki67)抗体PV9000试剂盒DAB购于北京中山生物技术有限公司。
2.3 免疫组织化学法：标本常规石蜡包埋，4μm连续切片，采用PV法进行免疫组化染色，染色过程严格按试剂盒染色程序进行，选取已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。观察细胞核增殖相关抗原(Ki67)，阳性物质呈棕黄色细颗粒状于细胞核表达，采用美国PENGUIN-600CL图像分析系统进行图像分析，选取病变处每500个细胞Ki67的阳性表达率作为其阳性表达指数。统计学处理应用SPSS10.0软件包进行方差分析。
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3 结果
3.1 中医各证型所占比例以及年龄、性别分布：各证型比例，气血两虚瘀阻组10例(31.25%)，脉络瘀热组10
例(31.25%)，气阴两虚瘀阻组4例(12.5%)，脉络热毒组8例(25.0%)。年龄、性别分布情况，见表1。
表1 32例患者年龄、性别分布 n(%)
性别n50~60岁61~70岁71~80岁80岁以上男24( 75.0)4(12.5) 8(25.0)11(34.4)1(3.1)女 8( 25.0)1( 3.1) 3( 9.3) 4(12.5)0 总计32(100.0)5(15.6)11(34.4)15(46.9)1(3.1)3.2 免疫组织化学法观察各证型Ki67表达差异：具体情况见表2。
表2 各证型Ki67阳性表达指数比较 (%)
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证型Ki67阳性表达指数脉络热毒 4.87±1.01*气阴两虚瘀阻1.86±0.47脉络瘀热1.49±0.13气血两虚瘀阻0.30±0.18注：与气血两虚瘀阻型比较，*P[3]。有人认为它可能是具有蛋白结合特性的重要结构，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[4]，是一个反映细胞增殖的敏感指标。
在糖尿病足的不同辨证分型中气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中Ki67表达均呈阳性，在脉络热毒证中表达最强、气血两虚瘀阻证中表达最弱，二者相比具有显著性差异(P<0.05)。根据Ki67阳性指数可以判断细胞增殖的活性，指明细胞增殖与糖尿病足动脉病变的关系。在糖尿病足的不同辨证分型中动脉的硬化闭塞程度由轻到重依次是脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证。Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关。而在通过对32例糖尿病足截肢的动脉进行病理学观察的过程中发现糖尿病足血管病变主要体现在中动脉的病理学变化，其中脉络热毒、气阴两虚瘀阻两证型以动脉周围及全层的炎症性改变为主；脉络瘀热、气血两虚瘀阻证以中膜钙化、平滑肌细胞萎缩、变性、坏死及胶原纤维增多及内膜粥样斑块形成为主，炎症表现不明显；而Ki67的阳性指数与血管炎症病变程度呈正相关。这说明炎症在糖尿病的大血管病变的过程中起了重要的作用，特别是在脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证两型，这对临床具有重要的指导意义。
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5 参考文献
1 Boulton A J. The diabetic foot：a global view. Diabetel Metab Res Rev，2000，16(1)：2.
2 许樟荣，敬华.糖尿病足国际共识.中华糖尿病学会第二届足病第一次足病研讨会.2002，435.
3 Schulter C，Duchrow M,Wohlenberg C,et al.Molecularcloing ofthecell proliferation associated nuclearantigend efined by antibody Ki67：anuniquege neencoding foranew ，PEST protein.Cell Biol，1993，123(3)：513.
4 Namita S，Peter A.Ki67 structure function and new antibodies.Pathol，1992，168：161., http://www.100md.com(常 柏 李巧芬 张庚扬)
关键词 糖尿病足 中医证型 胫后动脉 血管细胞核增殖相关抗原 临床研究
糠尿病足是糖尿病的严重并发症，据统计1996年全球糖尿病患者1.2亿，预计到2025年，将达到2.5亿以上，而大约15%的糖尿病患者将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽[1]。目前对于糖尿病足病因及发病机制虽然还不是完全清楚，但大家公认糖尿病合并大血管病变导致动脉粥样硬化是糖尿病足发病的最主要因素。现将2004年10月～2005年5月间我们收治的32例糖尿病足患者的截肢动脉标本的血管细胞核增殖相关抗原(Ki67)与其中医辨证分型的相关性研究情况报告如下。
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1 临床资料
1.1 一般资料：32例均为天津医科大学代谢病医院和天津中医学院第一附属医院2004年10月～2005年5月间的住院患者，其中男性24例，女性8例；年龄50～86岁，平均年龄69.2岁；糖尿病病程最长30年，最短6年，平均18±2.4年。
1.2 诊断标准：糖尿病足的诊断标准采用2000年中华医学会糖尿病学会第二届糖尿病足会议所制订的“糖尿病足(肢端坏疽)检查方法及诊断标准”。
1.3 截肢标准：参照国际糖尿病足工作组编写的《糖尿病足国际共识》中关于“大截肢的定义、标准和指标”[2]执行。
1.4 中医辨证分型标准：参照《中医外科学(第七版)》及《中药新药临床研究指导原则·脱疽》之中医辨证分型方案分为气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证、脉络热毒证四型。
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2 观察方法
2.1 标本取材：坏疽截肢标本32例，其中按中医辨证分型气血两虚瘀阻组10例，脉络瘀热组10例，气阴两虚瘀阻组4例，脉络热毒组8例，取各例标本下肢胫后动脉。标本经过10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，备用。
2.2 设备、试剂：美国PENGUIN-600CL自动图像分析系统，细胞核增殖相关抗原(Ki67)抗体PV9000试剂盒DAB购于北京中山生物技术有限公司。
2.3 免疫组织化学法：标本常规石蜡包埋，4μm连续切片，采用PV法进行免疫组化染色，染色过程严格按试剂盒染色程序进行，选取已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。观察细胞核增殖相关抗原(Ki67)，阳性物质呈棕黄色细颗粒状于细胞核表达，采用美国PENGUIN-600CL图像分析系统进行图像分析，选取病变处每500个细胞Ki67的阳性表达率作为其阳性表达指数。统计学处理应用SPSS10.0软件包进行方差分析。
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3 结果
3.1 中医各证型所占比例以及年龄、性别分布：各证型比例，气血两虚瘀阻组10例(31.25%)，脉络瘀热组10
例(31.25%)，气阴两虚瘀阻组4例(12.5%)，脉络热毒组8例(25.0%)。年龄、性别分布情况，见表1。
表1 32例患者年龄、性别分布 n(%)
性别n50~60岁61~70岁71~80岁80岁以上男24( 75.0)4(12.5) 8(25.0)11(34.4)1(3.1)女 8( 25.0)1( 3.1) 3( 9.3) 4(12.5)0 总计32(100.0)5(15.6)11(34.4)15(46.9)1(3.1)3.2 免疫组织化学法观察各证型Ki67表达差异：具体情况见表2。
表2 各证型Ki67阳性表达指数比较 (%)
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证型Ki67阳性表达指数脉络热毒 4.87±1.01*气阴两虚瘀阻1.86±0.47脉络瘀热1.49±0.13气血两虚瘀阻0.30±0.18注：与气血两虚瘀阻型比较，*P[3]。有人认为它可能是具有蛋白结合特性的重要结构，在有丝分裂中起着维持DNA规则结构的重要作用[4]，是一个反映细胞增殖的敏感指标。
在糖尿病足的不同辨证分型中气血两虚瘀阻证、脉络热毒证、脉络瘀热证、气阴两虚瘀阻证中Ki67表达均呈阳性，在脉络热毒证中表达最强、气血两虚瘀阻证中表达最弱，二者相比具有显著性差异(P<0.05)。根据Ki67阳性指数可以判断细胞增殖的活性，指明细胞增殖与糖尿病足动脉病变的关系。在糖尿病足的不同辨证分型中动脉的硬化闭塞程度由轻到重依次是脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证、脉络瘀热证、气血两虚瘀阻证。Ki67的阳性表达与糖尿病足动脉硬化闭塞程度呈负相关。而在通过对32例糖尿病足截肢的动脉进行病理学观察的过程中发现糖尿病足血管病变主要体现在中动脉的病理学变化，其中脉络热毒、气阴两虚瘀阻两证型以动脉周围及全层的炎症性改变为主；脉络瘀热、气血两虚瘀阻证以中膜钙化、平滑肌细胞萎缩、变性、坏死及胶原纤维增多及内膜粥样斑块形成为主，炎症表现不明显；而Ki67的阳性指数与血管炎症病变程度呈正相关。这说明炎症在糖尿病的大血管病变的过程中起了重要的作用，特别是在脉络热毒证、气阴两虚瘀阻证两型，这对临床具有重要的指导意义。
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5 参考文献
1 Boulton A J. The diabetic foot：a global view. Diabetel Metab Res Rev，2000，16(1)：2.
2 许樟荣，敬华.糖尿病足国际共识.中华糖尿病学会第二届足病第一次足病研讨会.2002，435.
3 Schulter C，Duchrow M,Wohlenberg C,et al.Molecularcloing ofthecell proliferation associated nuclearantigend efined by antibody Ki67：anuniquege neencoding foranew ，PEST protein.Cell Biol，1993，123(3)：513.
4 Namita S，Peter A.Ki67 structure function and new antibodies.Pathol，1992，168：161., http://www.100md.com(常 柏 李巧芬 张庚扬)