三七总皂苷对糖尿病大鼠肾皮质p22phoxmRNA表达的影响(1)
糖尿病肾病(DN)的发病机制尚不完全清楚，目前已知氧化应激反应增强、活性氧(ROS)产生增多在糖尿病肾病的发生发展中发挥了重要的作用。最近，NAD(P)H氧化酶因参与氧化应激过程而受到关注，P22phox是NAD(P)H氧化酶的一个必需亚单位，在维持其活性中起重要作用。临床研究表明中药三七对DN有着良好的疗效，本实验通过观察三七总皂苷(PNS)对糖尿病大鼠肾皮质p22phox mRNA表达的影响及其对肾脏的保护作用，以探讨三七总皂苷防治DN的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物：SD清洁级3月龄大鼠35只，雄性，体重150～200g，浙江省医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物室，室温21～25℃。
1.2 试剂：链脲佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)为美国Sigma公司产品；血栓通胶囊(每粒含三七总皂苷100mg)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品；血糖测定试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供；尿蛋白定量测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供；总RNA抽提试剂Trizol、逆转录酶试剂盒、Taq DNA聚合酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；DNA梯度Marker由Takara公司提供。
, 百拇医药
1.3 引物：搜索GenBank数据库大鼠p22phox mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计p22phox及内参GAPDH引物，委托上海生工生物工程公司合成，序列如下：p22phox引物：上游：5’-GACGCTTCACGCAGTGGTACT-3’，下游：5’-CACGACCTCATCTGTCACTGG-3’，目标长度：485bp；GAPDH引物：上游：5’-GTCGGTGTGAACGGATTT-3’，下游：5’-ACTCCACGACGTACTCAGC-3’，目标长度：276bp。
1.4 方法与步骤：分述如下。
1.4.1 造模、分组及治疗：适应性饲养大鼠1周。造模前将所有大鼠随机分为正常对照组(NC组，6只)和造模组(29只)。STZ临用前用0.1mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配成2%的溶液，放于冰浴中。糖尿病造模组大鼠禁食不禁水14小时，将STZ以65mg/kg一次性于大鼠左下腹腔注射造模，两小时后给大鼠进食。正常对照组按相同的方法和剂量注射枸橼酸钠溶液。72h后至少连续3天尾静脉检测血糖(Glucose Glu)。以连续3次血糖>16.65mmol/L，尿量>原尿量的150%，饮水明显增多者为大鼠糖尿病成模标准[1，2]。造模后选取符合成模标准，状态稳定的糖尿病大鼠(24只)，随机分为糖尿病模型组(DM组，8只)，三七总皂苷组(PNS组，8只)和氨基胍组(AG组，8只，在实验过程中死掉1只)，并予药物进行干预。其中，PNS组给予三七总皂苷100mg·kg-1·d-1灌胃，AG组给予氨基胍100mg·kg-1·d-1灌胃，DM组及NC组给予生理盐水1ml·100g-1·d-1灌胃。共8周。
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1.4.2 标本收集与处理：用药后8周末于处死大鼠前一天，用代谢笼收集大鼠24h尿标本，记录尿量后取5ml保存于-30℃冰箱中；大鼠称重后，从股静脉采血，分离血清待测；随后处死大鼠，取双肾，去掉肾包膜称重，右肾用10%中性福尔马林溶液固定，行PAS染色，左肾液氮冷冻，-70℃冰箱冻存，提取RNA。
1.4.3 指标检测：采用日立-7020型全自动生化分析仪检测血糖，用考马斯亮兰法检测尿蛋白，并计算24小时尿蛋白定量。
1.4.4 肾组织病理学检查及肾小球细胞外基质的检测：取适量右肾组织行石蜡包埋，制成厚度为3 μm切片，行PAS染色，光镜下观察大鼠肾脏病理变化。用北京航空航天大学全自动图像分析系统对PAS染色切片进行分析，每张切片按顺时针方向随机取10个完整正切肾小球，经分析系统计算每个肾小球PAS阳性染色面积与整个肾小球面积之比值，然后求10个肾小球此比值的均数，即为每张切片肾小球细胞外基质(ECM)的相对含量[3]。
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1.4.5 肾皮质p22phox mRNA的检测：分别取各组大鼠肾皮质100mg，按Trizol试剂说明书操作，提取总RNA，所得RNA用紫外分光光度计测260nm/280nm处的紫外吸收值(OD值)，每个样品重复测3次。结果：所提取的RNA，A260/280比值约在1.8～2.0。将所提取的总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s和28s三条带，证实RNA无降解。
取5μg RNA样品，1μl Oligo(dT)18加入一无RNA酶的200μl薄壁PCR管中，用灭活DEPC水补足至10μl，混匀。65℃加热10min，迅速冰水浴5min，短暂离心。按下列顺序加入：5×Buffer 4μ，dNTP(10mM)1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，M-MLV逆转录酶(200U/μl)0.8μl，DEPC水最终补足至20μl混匀，42℃保温60min，95℃加热5min，立即冰水浴冷却5min，短暂离心。反应产物-20℃冻存。
取上述逆转录反应产物10μl行反转录聚核酶链反应(PCR)，按下列步骤操作(30μl反应体系)：cDNA10μl，10×Buffer 2.5μl，MgCl2(25Mm)2μl，dNTP(10mM)0.5μl，p22phox引物正、负引物各0.5μl，DEPC-H2O 13.8μl，TaqDNA酶0.2μl。将上述各成分混匀，先95℃变性10min，然后94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环扩增，72℃延伸10min。PCR产物-20℃冻存。
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GAPDH的PCR扩增按下列步骤操作(30μl反应体系)：cDNA3μl，10×Buffer3μl，MgCl2(25Mm)1.8μl，dNTP(10mM)0.6μl，GAPDH引物正、负引物各0.5μl，DEPC-H2O 21.1μl，TaqDNA酶0.5μl。将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性50秒，56℃退火40秒，72℃延伸1min，进行28个循环扩增，72℃延伸7min。PCR产物-20℃冻存。
取8μl PCR产物与2μl上样液混合，以2%琼脂糖(含溴化乙锭0.5g/ml)，在1×TAE缓冲液中，电压80V的条件下电泳，电泳结果在紫外灯下观察，以GAPDH为内参照，用凝胶扫描成像系统对产物进行半定量分析，结果以p22phox与对应的GAPDH密度积分比值表示p22phox mRNA相对表达量。
1.5 统计学处理：所有数据均以均数±标准差表示，样本均数组间的比较用One-Way ANOVA(单因素方差分析)方法，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane’s T2检验。P0.05)；与NC组比较，DM组、PNS组、AG组血糖明显升高(P0.05)；DM组24 h尿蛋白定量与NC组相比有明显增高(P0.05)，PNS组与AG组比较差异不明显(P>0.05)。提示PNS与AG均不能延缓糖尿病大鼠消瘦的进程，均不能降低糖尿病大鼠的血糖，糖尿病大鼠在持续高血糖状态8周后，24 h尿蛋白定量较正常大鼠升高，PNS与AG能减少糖尿病大鼠24 h尿蛋白定量至正常水平，其作用效果相似。, 百拇医药(傅珍春 徐 刚 于淑娟)
1 材料与方法
1.1 实验动物：SD清洁级3月龄大鼠35只，雄性，体重150～200g，浙江省医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于清洁级动物室，室温21～25℃。
1.2 试剂：链脲佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)为美国Sigma公司产品；血栓通胶囊(每粒含三七总皂苷100mg)为黑龙江珍宝岛制药有限公司产品；血糖测定试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供；尿蛋白定量测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供；总RNA抽提试剂Trizol、逆转录酶试剂盒、Taq DNA聚合酶由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；DNA梯度Marker由Takara公司提供。
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1.3 引物：搜索GenBank数据库大鼠p22phox mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计p22phox及内参GAPDH引物，委托上海生工生物工程公司合成，序列如下：p22phox引物：上游：5’-GACGCTTCACGCAGTGGTACT-3’，下游：5’-CACGACCTCATCTGTCACTGG-3’，目标长度：485bp；GAPDH引物：上游：5’-GTCGGTGTGAACGGATTT-3’，下游：5’-ACTCCACGACGTACTCAGC-3’，目标长度：276bp。
1.4 方法与步骤：分述如下。
1.4.1 造模、分组及治疗：适应性饲养大鼠1周。造模前将所有大鼠随机分为正常对照组(NC组，6只)和造模组(29只)。STZ临用前用0.1mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH4.4)配成2%的溶液，放于冰浴中。糖尿病造模组大鼠禁食不禁水14小时，将STZ以65mg/kg一次性于大鼠左下腹腔注射造模，两小时后给大鼠进食。正常对照组按相同的方法和剂量注射枸橼酸钠溶液。72h后至少连续3天尾静脉检测血糖(Glucose Glu)。以连续3次血糖>16.65mmol/L，尿量>原尿量的150%，饮水明显增多者为大鼠糖尿病成模标准[1，2]。造模后选取符合成模标准，状态稳定的糖尿病大鼠(24只)，随机分为糖尿病模型组(DM组，8只)，三七总皂苷组(PNS组，8只)和氨基胍组(AG组，8只，在实验过程中死掉1只)，并予药物进行干预。其中，PNS组给予三七总皂苷100mg·kg-1·d-1灌胃，AG组给予氨基胍100mg·kg-1·d-1灌胃，DM组及NC组给予生理盐水1ml·100g-1·d-1灌胃。共8周。
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1.4.2 标本收集与处理：用药后8周末于处死大鼠前一天，用代谢笼收集大鼠24h尿标本，记录尿量后取5ml保存于-30℃冰箱中；大鼠称重后，从股静脉采血，分离血清待测；随后处死大鼠，取双肾，去掉肾包膜称重，右肾用10%中性福尔马林溶液固定，行PAS染色，左肾液氮冷冻，-70℃冰箱冻存，提取RNA。
1.4.3 指标检测：采用日立-7020型全自动生化分析仪检测血糖，用考马斯亮兰法检测尿蛋白，并计算24小时尿蛋白定量。
1.4.4 肾组织病理学检查及肾小球细胞外基质的检测：取适量右肾组织行石蜡包埋，制成厚度为3 μm切片，行PAS染色，光镜下观察大鼠肾脏病理变化。用北京航空航天大学全自动图像分析系统对PAS染色切片进行分析，每张切片按顺时针方向随机取10个完整正切肾小球，经分析系统计算每个肾小球PAS阳性染色面积与整个肾小球面积之比值，然后求10个肾小球此比值的均数，即为每张切片肾小球细胞外基质(ECM)的相对含量[3]。
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1.4.5 肾皮质p22phox mRNA的检测：分别取各组大鼠肾皮质100mg，按Trizol试剂说明书操作，提取总RNA，所得RNA用紫外分光光度计测260nm/280nm处的紫外吸收值(OD值)，每个样品重复测3次。结果：所提取的RNA，A260/280比值约在1.8～2.0。将所提取的总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳显示5s、18s和28s三条带，证实RNA无降解。
取5μg RNA样品，1μl Oligo(dT)18加入一无RNA酶的200μl薄壁PCR管中，用灭活DEPC水补足至10μl，混匀。65℃加热10min，迅速冰水浴5min，短暂离心。按下列顺序加入：5×Buffer 4μ，dNTP(10mM)1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，M-MLV逆转录酶(200U/μl)0.8μl，DEPC水最终补足至20μl混匀，42℃保温60min，95℃加热5min，立即冰水浴冷却5min，短暂离心。反应产物-20℃冻存。
取上述逆转录反应产物10μl行反转录聚核酶链反应(PCR)，按下列步骤操作(30μl反应体系)：cDNA10μl，10×Buffer 2.5μl，MgCl2(25Mm)2μl，dNTP(10mM)0.5μl，p22phox引物正、负引物各0.5μl，DEPC-H2O 13.8μl，TaqDNA酶0.2μl。将上述各成分混匀，先95℃变性10min，然后94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1.5min，进行30个循环扩增，72℃延伸10min。PCR产物-20℃冻存。
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GAPDH的PCR扩增按下列步骤操作(30μl反应体系)：cDNA3μl，10×Buffer3μl，MgCl2(25Mm)1.8μl，dNTP(10mM)0.6μl，GAPDH引物正、负引物各0.5μl，DEPC-H2O 21.1μl，TaqDNA酶0.5μl。将上述各成分混匀，先94℃变性3min，然后94℃变性50秒，56℃退火40秒，72℃延伸1min，进行28个循环扩增，72℃延伸7min。PCR产物-20℃冻存。
取8μl PCR产物与2μl上样液混合，以2%琼脂糖(含溴化乙锭0.5g/ml)，在1×TAE缓冲液中，电压80V的条件下电泳，电泳结果在紫外灯下观察，以GAPDH为内参照，用凝胶扫描成像系统对产物进行半定量分析，结果以p22phox与对应的GAPDH密度积分比值表示p22phox mRNA相对表达量。
1.5 统计学处理：所有数据均以均数±标准差表示，样本均数组间的比较用One-Way ANOVA(单因素方差分析)方法，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane’s T2检验。P0.05)；与NC组比较，DM组、PNS组、AG组血糖明显升高(P0.05)；DM组24 h尿蛋白定量与NC组相比有明显增高(P0.05)，PNS组与AG组比较差异不明显(P>0.05)。提示PNS与AG均不能延缓糖尿病大鼠消瘦的进程，均不能降低糖尿病大鼠的血糖，糖尿病大鼠在持续高血糖状态8周后，24 h尿蛋白定量较正常大鼠升高，PNS与AG能减少糖尿病大鼠24 h尿蛋白定量至正常水平，其作用效果相似。, 百拇医药(傅珍春 徐 刚 于淑娟)