大黄NFAE6虫丸对肝纤维化大鼠肝组织AT1R及其mRNA表达的影响
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关键词 大黄NFAE6虫丸 肝纤维化 血管紧张素Ⅱ1型受体 二甲基亚硝胺 大鼠
肝纤维化是各种慢性肝病共同的病理学基础,是诸多慢性肝病向肝硬化甚至肝癌发展的必经阶段,其核心环节是肝星状细胞(HSC)的活化并向肌成纤维样细胞和成纤维细胞的转化,阻断或逆转肝纤维化是治疗各种慢性肝病的关键。肝局部存在肾素血管紧张素系统(RAS),其成分通过血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)可促进肝星状细胞活化从而参与肝纤维化的发展[1]。大黄NFAE6虫丸抗肝纤维化治疗疗效确切[2],但其抗肝纤维化作用机制是否与AT1 R有关未见报道。本实验通过观察大黄NFAE6虫丸对二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化模型大鼠的治疗作用,研究其对肝组织AT1 R及其m RNA表达的影响,从RAS角度初步探讨大黄NFAE6虫丸抗肝纤维化的作用机制。
1 材料
1.1 动物:清洁级SD大鼠50只,雄性,体重160±20g,由浙江中医药大学实验动物中心提供并饲养。
1.2 主要药物与试剂:大黄NFAE6虫丸:3g/袋,湖南回春堂药业有限公司产品(批号:20080410);复方鳖甲软肝片:0.5g/片,内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司产品(批号:20080317);二甲基亚硝胺:天津市化学试剂公司出品。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒均为上海科欣生物技术研究所产品,(批号分别为:20071203、080101);Trizol试剂:美国Invitrogen公司产品(批号:1382739);AT1R免疫组化试剂盒:河北博海生物工程开发有限公司产品(批号:080713);RT-PCR试剂盒:上海科延生物技术有限公司产品(批号:070602)。
1.3 引物:大鼠AT1 R上游引物:5’-CAC GCT TTC TTA CCG-3’,下游引物:5’-TGA CTA CAG GGA CAA CA-3’;β—肌动蛋白(β-actin)上游引物:5’ATG CCA TCC TGC GTC TG 3’,下游引物:5’GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT 3’。引物由上海博尚生物科技有限公司合成。
1.4 实验仪器:组织切片机(德国Leca公司),恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂),PCR循环仪(德国Biometra公司),多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国Media Cybernetics公司),GIS凝胶图像分析处理系统(上海天能科技有限公司)。
2 方法
2.1 肝纤维化模型制备及分组:50只雄性SD大鼠随机分为造模组及正常对照组。除正常对照组大鼠10只外,其余40只大鼠按10mg/kg体重每周一、二、三连续3次腹腔注射1%浓度的DMN进行造模,连续注射4周共12次[3],4周后将存活的35只大鼠随机分为模型对照组12只、大黄NFAE6虫丸组12只、阳性对照组(复方鳖甲软肝片)11只。
2.2 实验用药:将大黄NFAE6虫丸与复方鳖甲软肝片分别用蒸馏水溶解制成混悬液,按人与大鼠体表面积比折算的等效剂量给药。大黄NFAE6虫丸按1.08g/kg体重灌胃给药,复方鳖甲软肝片按1g/kg体重灌胃给药。模型组与正常组以生理盐水10ml/kg体重灌胃,各组均每天给药1次,时间持续2周。
2.3 大鼠处理方法:末次给药当晚禁食不禁水,次日上午空腹按40mg/kg剂量腹腔注射1%的戊巴比妥麻醉,腹腔静脉采血,离心机分离取血清,-20℃冰箱保存备用。迅速分离肝脏,取大鼠肝左叶肝组织入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定,逐级酒精脱水,经透明、常规石蜡包埋,用作肝组织HE染色、苦味酸-天狼红胶原染色及免疫组织化学染色指标的检测。其余新鲜肝脏经生理盐水清洗后立即投入液氮中冻存,3小时后移入-70℃低温冰箱中保存,用于提取总核糖核酸(RNA)及RT-PCR检测。
2.4 检测指标及方法:血清ALT、AST采用赖氏法检测,按试剂盒说明书操作。肝组织行HE和苦味酸-天狼红染色,光镜下观察肝组织病理变化与肝纤维化程度,依照实验动物肝纤维化组织学Ⅵ级标准和改良的Chevallier肝纤维化SSS半定量计分标准进行肝纤维化程度评判。肝组织AT1R的表达采用免疫组织化学SP法检测。逆转录—聚合酶链反应法(RT-PCR法)检测肝组织AT1RmRNA的表达:用Trizol一步法抽提肝组织总RNA,。逆转录后使用上述引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经琼脂糖电泳,GIS凝胶图像分析处理系统对电泳条带进行光密度值扫描,用AT1R/β-actin的光密度比值表示AT1R的mRNA表达的相对水平。
2.5 统计学处理:采用SPSS 13.0统计软件包进行数据的分析处理,结果以均数±标准差(x±s)表示,对计量资料采用单因素方差分析,对等级计数资料采用非参数秩和检验,检验其差异显著性,均以P<0.05或P<0.01为差异显著性的标准。
3 结果
3.1 大黄NFAE6虫丸对DMN致肝纤维化大鼠血清ALT及AST的影响:结果见表1。模型组大鼠血清ALT、AST水平较正常组显著升高(P<0.05),大黄NFAE6虫丸组与阳性对照组大鼠血清ALT、AST水平较模型组皆明显下降(P<0.05),但较正常组明显升高(P<0.05)。大黄NFAE6虫丸组与阳性对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
3.2 对各组大鼠肝脏病理学的观察:正常组大鼠肝小叶结构完整,无变性、坏死,肝细胞索排列整齐。肝组织基本无胶原分布,仅在中央静脉和汇管区周围以及肝窦内有少量分布。模型组大鼠肝小叶结构破坏,肝细胞索排列紊乱,可见肝细胞不同程度的炎性坏死,炎性细胞浸润严重。胶原纤维明显增生,相互连接的纤维隔将肝小叶重新分割形成假小叶。大黄NFAE6虫丸组与阳性对照组肝细胞坏死、炎性细胞浸润程度轻于模型组。模型组大鼠肝组织肝纤维化SSS计分明显高于正常组(P<0.01),两药物组大鼠肝组织肝纤维化SSS计分明显低于模型组(P<0.05),两药物组间比较,大鼠肝组织肝纤维化SSS计分无显著性差异(P>0.05)。见表2。
3.3 各组大鼠肝组织AT1R及其mRNA表达变化:见表3。模型组大鼠肝组织AT1R表达面积及其mRNA的表达水平比较正常组显著升高(P<0.05,P<0.01);大黄NFAE6虫丸组和阳性对照组大鼠肝组织AT1R表达面积及其mRNA的表达水平比较则显著低于模型组(P<0.05);大黄NFAE6虫丸组与阳性对照组比较则无显著性差异(P>0.05)。
4 讨论
研究证实,肝纤维化时激活的HSC大量表达AT1R,同时合成血管紧张素Ⅱ,血管紧张素Ⅱ又与HSC细胞膜上的AT1R结合刺激其增殖和胶原合成,从而进一步促进肝纤维化的形成[4]。AT1R拮抗剂能有效抑制肝纤维化进程,提示肝局部RAS与肝纤维化密切相关。
本研究结果显示,大黄NFAE6虫丸可明显改善DMN诱导的肝纤维化大鼠的肝纤维化程度,降低血清ALT、AST水平 ......
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