叶下珠复方联合拉米夫定对拉米夫定耐药性肝炎抗病毒免疫机制的研究
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关键词 叶下珠复方 拉米夫定 耐药性乙型肝炎 抗病毒免疫学
中医药在治疗慢性乙型肝炎(CHB)中已显示出良好的抗病毒、调整免疫、改善肝脏炎症及防治肝纤维化的作用，但对中西医结合治疗拉米夫定耐药性肝炎(LRHB)的疗效及作用机制知之甚少。笔者拟用叶下珠复方联合拉米夫定对LRHB抗病毒免疫机制进行研究。
1 材料和方法
1.1 入选标准：①所有病例诊断均符合2000年9月西安会议制定的“病毒性肝炎防治方案”CHB标准；②服用拉米夫定(LAM)6个月以上，筛选时仍在服用；经LAM治疗后HBV-DNA转阴，丙氨酸氨基转移酶(ALT)复常，在未停用LAM的情况下，出现HBV—DNA、HBsAg阳转，并伴有ALT≥2×正常值高限(ULN)，并持续至少1个月，或6个月以内反复增高；经实验室检查证实患者出现YMDD变异。
1.2 排除标准：入院时查血清丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)-IgM、甲型肝炎病毒(HAV)-IgM或抗艾滋病病毒(抗HIV)阳性者；②失代偿性慢性肝病、自身免疫性肝病、遗传性肝病者；③骨髓抑制、肾功能异常(肌酐超出正常上限1.5倍)、甲胎蛋白(AFP)明显升高(≥100ng/m1)、有严重器质性疾病、精神病、嗜酒、吸毒者；④筛选前6个月用过抗病毒药、免疫增强或抑制剂、细胞毒性药物或类固醇激素者；⑤妊娠及哺乳期，有受孕可能而未能采取有效避孕措施者；⑥对核苷类药物或叶下珠复方过敏者；⑦排除其他诱发肝炎活动的病因者。
1.3一般资料：60例LRHB病例选自2005年10月至2009年2月在广州中医药大学第一附属医院及广州中医药大学第三附属医院接受门诊和住院治疗的CHB患者。60例患者按随机数字分为A组(叶下珠复方组)、B组(拉米夫定组)、C组(叶下珠复方+拉米夫定组)。3组在性别、年龄、拉米夫定服药时间、HBV-DNA、ALT及HBsAg阳性比等各个方面的差异经统计学处理，具有可比性。
1.4 治疗方法：在对症护肝的基础上，A组患者服用叶下珠复方胶囊(主要成份为叶下珠、黄芪、三七、甘草等，由广州中医药大学热带病所研制，每粒含生药0.65g，批号为00412)，每次4粒，每日3次口服，6个月为1用药疗程。B组患者继续服用拉米夫定(由英国Glaxowellcome公司生产，每次100mg，每天1次，早晨空腹口服)。C组患者服用叶下珠复方胶囊+拉米夫定，剂量、用法、疗程同各单药组。
1.5 观察项目与方法：对患者每2周随访1次，记录患者症状、体征及不良反应情况。治疗前、治疗后6个月均检测T淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞(NK)、白细胞介素一2(IL一2)分泌细胞和HBV-DNA载量。
1.5.1 血清HBV-DNA的检测：采用核酸扩增(PCR)荧光定量检测，试剂系中山医科大学达安生物工程有限公司生产。
1.5.2 免疫功能检测：应用流式细胞仪免疫荧光法检测外周血T淋巴细胞亚群百分率、自然杀伤细胞；应用放免法检测血清IL-2，试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。具体检测方法见试剂盒说明书。
1.6 统计方法：全部数据使用Excel 2000电子表格建立数据库文件。计量资料参数以均数±标准差表示(x±s)，其中对HBV-DNA-PCR结果进行对数转换(拷贝数logl0数值)，每组参数均经过正态性检验，符合正态分布。采用SPSS12.0多元统计软件、EPI软件包进行统计处理，计数资料比较用Y2检验，等级资料用Ridit分析，治疗前后比较用配对￡检验，各组问比较用ANOVA检验；治疗前后免疫功能和HBV-DNA载量变化之间的相关关系运用多元回归与相关分析。显著性水平a=0.05。
2 结果
2.1 3组治疗前后T细胞亚群均值变化：详见表1。治疗前后比较，A组、C组之CD3+、CD4+细胞百分比均增加，CD8+细胞百分比均减少(P<0.05或P<0.01)。而B组虽能增加CD3+、CD4+细胞百分比和减少CD8+细胞百分比，但与治疗前比较无显著性差异(P>0.05)。
2.2 3组治疗前后NK细胞、IL-2均值比较：详见表2。C组能非常显著性提高NK细胞活性和IL-2分泌(P<0.01)；A组仅对NK细胞有正向激活作用(P<0.05)，对IL-2则无显著影响。而B组治疗前后NK细胞、IL-2均值均无显著性差异(P>0.05)。
2.3 3组治疗前后HBV-DNA水平对数值比较：详见表3。经方差分析(ANOVA)检验，3组治疗前比较均无显著性差异(P>0.05)。经配对t检验，A组治疗前后、B组治疗前后比较均有显著性差异(P<0.05)；C组治疗前后有非常显著性差异(P<0.01)。
2.4 3组治疗前后血清HBV-DNA与免疫功能的相关性研究：C组治疗前后CD4+百分比、NK细胞的增加与HBV-DNA载量的减少呈显著正相关(其中CD4+与HBV DNA之间相关系数r=0.87，P=0.012，<0.01；NK细胞与HBV-DNA之间r=0.613，P=0.026，<0.05)。A组治疗前后CD3+百分比的增加与HBV—DNA载量减少呈显著正相关(r=0.428，P=0.038<0.05)。
3 讨论
研究发现，单纯使用抗病毒药物如LAM治疗正处于免疫耐受期的慢性乙型肝炎疗效不佳。因为在HBV的复制和表达过程中，HBV进入肝细胞后脱去其外膜及核壳，HBV-DNA深伏于肝细胞核内成为双链闭合环状前病毒DNA，它是HBV复制的原始模板，而现在所有的抗病毒药物仅是对HBV复制有抑制作用，并无直接灭活HBV的作用。因为这些药物均不能进入肝细胞，更不能直接作用于乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV CCC DNA)。虽然LAM作为一种核苷类抗病毒药，能抑制病毒DNA合成，干扰HBV逆转录酶活性，从而抑制乙肝病毒复制，但该药无直接免疫调节作用。只能降低血清病毒量，对肝细胞内病毒状态无影响，短期治疗无法彻底清除病毒，且停药后易复发。由此可见。运用LAM治疗时机体免疫功能与病毒清除密切相关。长期用LAM治疗的患者在出现病毒反跳与YMDD变异后，继续使用LAM可抑制残余的野生株，因为变异株的复制能力及对肝功能的损坏较野生株轻，因此不会加重病情。组织学研究显示，变异发生后继续使用LAM仍可改善肝脏的组织学并阻止肝硬化的发生，变异并未导致肝脏Knodell组织学积分升高。因此YMDD变异的出现并不是停止LAM治疗的指标，临床上也不一定恶化和反跳。基于此，近年来出现的LAM联合用药已逐渐成为新的研究热点，即抗病毒、免疫调节、改善肝功能、抗纤维化等综合疗法的运用。一般认为中药的有效成分复杂，可通过多靶点、多途径起效，在调控免疫方面具有一定优势，疗效肯定，但其抗病毒机制尚较少研究。我们以往的临床试验证实，叶下珠复方联合拉米夫定治疗CHB具有较好的协同作用，能有效提高患者HBeAg和HBV—DNA阴转率。该复方单用或联合干扰素治疗CHB均取得了较好疗效。叶下珠复方是针对慢性乙型病毒性肝炎患者邪毒未清，正气已虚及气血失调的病机，应用清热解毒、活血化瘀及扶正同本的中医辨证论治原则，由叶下珠、田七等组成复方。本次研究在上述基础上，提出叶下珠复方可以作为拉米夫定耐药性肝炎治疗的联合用药选择，其作用机制可能是通过提高机体的细胞免疫功能，促进乙肝病毒的清除，减少病毒变异的发生，并对此假说进行系统全面的研究。
结果表明：C组治疗后CD4+百分比的增加、NK细胞的增加、A组治疗后CD3+百分比的增加均与HBV-DNA载量的减少呈显著正相关。如同非溶细胞机理一样，HBV特异性CD8+T细胞用于破坏感染的肝细胞，能清除细胞内HBV，从而减少感染细胞的数目。说明联合用药能更好地改善LRHB患者T淋巴细胞亚群的异常及提高NK细胞活性，提高抗病毒疗效，同时能调节患者免疫功能，使免疫功能低下或紊乱调整到正常，显示出较好的抗HBV效果。相对于单纯拉米夫定治疗，叶下珠复方单用或联合拉米夫定治疗期间宿主免疫系统的恢复或刺激可引起感染肝细胞的清除加强。
因此，叶下珠复方联合拉米夫定可能在一定程度上提高治疗LRHB的疗效，并可能减少YMDD的变异、提高细胞免疫功能，这为临床上提高治疗LRHB的疗效以及推迟和预防拉米夫定耐药株的发生提供一种较为有效的方法，值得进一步观察。, 百拇医药(刘亚梅)