高秀飞 刘 培 葛玉清

    浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

    华佗在《中藏经》中提出：“夫痈疽疮肿之所作也，皆五脏六府蓄毒不流则生矣，非独因荣卫壅塞而发者也。”“脏腑蓄毒不化”可能是产生肿瘤的原因。由此，乳腺癌的发生是在“蓄毒”病因的长期刺激下导致“脏腑蓄毒不化”而致“癌毒内生”的过程。“蓄毒”不仅可以影响脏腑气血，导致脏腑失调，影响气血津液的运行，导致痰、瘀内生。痰、瘀、毒相互影响、转化，三者胶着，共同促进了乳腺癌的发展。本实验以化瘀的莪术为对照，观察化痰的蛇六谷对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠肺转移的影响，为中医药抗乳腺癌“痰、瘀、毒”理论提供实验依据。

    1 材料

    1.1 主要试剂与仪器：RRPMI1640培养基、胎牛血清为美国GIBCO公司产品，CCK-8 Kit(细胞计数CCK8试剂盒)为日本DOJINDO公司产品、二甲基亚砜(DMSO)为SIGMA公司产品。洁净工作台(上海净化设备厂)，CO2培养箱(SANYO，日本)。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯。生物发光成像仪(XGI-8 Gas Anesthesia System)Matrigel basement membrane matrix(BD公司产品)，医用显微镜(Nikon，日本)，血球计数板，BX60显微镜(Olympus，日本)，Chemilmayer 5500/Spectralmayer 5000显微彩色图像分析系统(安莱生命科技有限公司)。DEPC(Sigma),TRIzol(Gibco BRL)；Super-Script反转录酶及其缓冲液(Gibco BRL)；Taq DNA聚合酶及其缓冲液(Roche)；dNTP(Roche)；目的基因引物及探针：Takara公司合成。

    1.2 细胞：人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231由浙江省医学科学院肿瘤研究所惠赠。用10%胎牛血清和10ug/ml人胰岛素的RPMI1640培养液，在37℃细胞培养箱培养备用。构建表达GFP-荧光素酶标记的MDA-MB-231亚细胞系MDA-MB-231-GFP：取经过五次传代的MDAMB-231细胞，用0.125%的胰蛋白酶消化后，吹打使其分散；4℃离心1000rpm/min、5min，吸走上清，再用无菌PBS洗涤2次；用细胞培养液重悬细胞，以每孔2×104个细胞/500μl接种24孔板，置37℃，5%CO2培养箱中培养；待细胞融合率为60%～70%且状态良好时用于慢病毒感染。在感染前将培养基换成低血清的培养基 ......