黄健莹 欧阳钦 吴春明 刘三海 王丽佳 赵安静 谢远太

    浙江中医药大学附属温州市中医院 浙江 温州 325000

    浙南名老中医任侠民先生以温州道地药材鸡骨草和垂盆草，创立二草清肝汤(EQD)，临床和基础研究证实对急性肝衰竭(ALF)有一定的疗效[1]。前期实验显示二草清肝汤(EQD)对免疫性肝损害大鼠的肝细胞凋亡具有保护作用，其机制与肝细胞内的PI3K/AKT/GSK3β 信号途径的活化受抑制有关[2]；最新研究显示ALF 小鼠肝组织Tott 样受体4(TLR4)mRNA 表达明显升高，EQD 能下调肝组织的TLR4 mRNA 表达[3]。据此，我们推测EQD 可能是通过肝细胞TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信号通路调控肝细胞凋亡。因此，本研究拟以脂多糖(LPS)构建人源HL-7702 肝细胞凋亡模型，在分子和细胞水平检测相关凋亡信号分子表达情况，为EQD 用于防治ALF 提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物和细胞：BALB/C，雄性，周龄6～8w，30只，许可证号：SCXK(湘)2019-0004，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；饲养环境：温度20～26℃，湿度40%～70%。人源HL-7702 肝细胞(货号：CL-0190)，购自普诺赛生物公司。

    1.2 实验药物：所用中药材均购自温州永安堂中药饮片公司，按原方比例(鸡骨草、垂盆草、茵陈各15g，制大黄3g，茯苓、泽泻、苍术各10g，陈皮、甘草各6g)，水煎2次合并药液，过滤浓缩至含生药3.3g/mL，加入其两倍的乙醇拌匀，沉淀后取得上清液；回收乙醇后浓缩得浸膏，加入糊精、蔗糖混匀，制粒即得。实验前取蒸馏水溶解，按1∶2∶3 比例分别制成二草清肝汤小剂量、中剂量和大剂量，以备实验时用。

    1.3 试剂：Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(批号：AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 联科生物)；GSK3β(批号：22104-1-AP，protein tech)；Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG(批号：As007，ABclonal)；即用型DAPI 染液(批号：KGA215-50，凯基)；CCK-8 法细胞增殖检测试剂盒(批号：KGA317，凯基生物)；Trizon Reagent(批号：CW0580S，CWBIO)；超纯RNA 提取试剂盒(批号：CW0581M，CWBIO)；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(批号：R223-01 ......