二草清肝汤含药血清对人源HL-7702肝细胞凋亡的影响及其机制研究*
培养皿,1材料与方法,2结果,3讨论
黄健莹 欧阳钦 吴春明 刘三海 王丽佳 赵安静 谢远太浙江中医药大学附属温州市中医院 浙江 温州 325000
浙南名老中医任侠民先生以温州道地药材鸡骨草和垂盆草,创立二草清肝汤(EQD),临床和基础研究证实对急性肝衰竭(ALF)有一定的疗效[1]。前期实验显示二草清肝汤(EQD)对免疫性肝损害大鼠的肝细胞凋亡具有保护作用,其机制与肝细胞内的PI3K/AKT/GSK3β 信号途径的活化受抑制有关[2];最新研究显示ALF 小鼠肝组织Tott 样受体4(TLR4)mRNA 表达明显升高,EQD 能下调肝组织的TLR4 mRNA 表达[3]。据此,我们推测EQD 可能是通过肝细胞TLR4/PI3K/AKT/GSK3β 信号通路调控肝细胞凋亡。因此,本研究拟以脂多糖(LPS)构建人源HL-7702 肝细胞凋亡模型,在分子和细胞水平检测相关凋亡信号分子表达情况,为EQD 用于防治ALF 提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细胞:BALB/C,雄性,周龄6~8w,30只,许可证号:SCXK(湘)2019-0004,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司;饲养环境:温度20~26℃,湿度40%~70%。人源HL-7702 肝细胞(货号:CL-0190),购自普诺赛生物公司。
1.2 实验药物:所用中药材均购自温州永安堂中药饮片公司,按原方比例(鸡骨草、垂盆草、茵陈各15g,制大黄3g,茯苓、泽泻、苍术各10g,陈皮、甘草各6g),水煎2次合并药液,过滤浓缩至含生药3.3g/mL,加入其两倍的乙醇拌匀,沉淀后取得上清液;回收乙醇后浓缩得浸膏,加入糊精、蔗糖混匀,制粒即得。实验前取蒸馏水溶解,按1∶2∶3 比例分别制成二草清肝汤小剂量、中剂量和大剂量,以备实验时用。
1.3 试剂:Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(批号:AP101-100-kit,MULTI SCIENCES 联科生物);GSK3β(批号:22104-1-AP,protein tech);Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG(批号:As007,ABclonal);即用型DAPI 染液(批号:KGA215-50,凯基);CCK-8 法细胞增殖检测试剂盒(批号:KGA317,凯基生物);Trizon Reagent(批号:CW0580S,CWBIO);超纯RNA 提取试剂盒(批号:CW0581M,CWBIO);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(批号:R223-01 ......
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