白色假丝酵母菌pACT1-GFP质粒的构建及表达(2)
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用斜体表示)退火后用T4 DNA连接酶连接到经限制性内切酶SalⅠ和MluⅠ双酶切的CIp10载体上，构建
pCYC1t。然后将酵母增强型绿色荧光蛋白基因序列yEGFP[5]插入到pCYC1t上的限制性内切酶Hind Ⅲ和
PstⅠ酶切位点之间。
1.3.2 构建pACT1-GFP 使用针对白色假丝酵母菌ACT1基因启动子序列设计的一对引物[6]，5’-ATCG-CTCGAGCTATTAAGATCACCAGCCTC和5’-CATAC-CACCAAGCTTTTTGAATGATTATATTTT(限制性内切酶Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点用斜体表示)，通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增白色假丝酵母菌ACT1基因启动子序列，然后将其连接到经限制性内切酶Xho Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的pCYC1t上，构建pACT1-GFP质粒。转化DH5α感受态细菌后经氨苄抗性及酶切初步鉴定，确定转化成功后，对插入片段进行基因测序分析以确定质粒构建成功。
1.4 白色假丝酵母菌转化
pACT1-GFP质粒经限制性内切酶StuⅠ酶切线
性化后根据醋酸锂介导的酵母菌转化方法(LiAc/SS
carrier DNA/PEG方法)转化白色假丝酵母菌CAI4
(ura3::λimm434/ura3::λimm434)菌株[7]，转化体系如下：240 μL聚乙二醇3350，36 μL 1 mol·L-1 LiAC，50 μL 2 g·L-1单链鲑精DNA，0.5～1.0 μg质粒DNA，加无菌去离子水补足360 μL，同时设阴性对照组(不加
入质粒)。最后用尿嘧啶缺陷SC培养基进行筛选确定转化成功 ......
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