血管内皮生长因子和转化生长因子β1基因调控人根尖乳头细胞矿化相关因子的研究(3)
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参见附件。
2 mL,孵育6 h后,改用15%胎牛血清的α-MEM培养。
实验分为未转染组(空白组)、转染pcDNA3.1hisA组(对照组)、转染pcDNA3.1hisA-VEGF165组(实验1组)、转染pcDNA3.1hisA-TGFβ1组(实验2组)以及共转染pcDNA3.1hisA-VEGF165和pcDNA3.1hisA-TGFβ1组(实验3组)。
1.2.7 RNA提取及逆转录反应 转染48 h后,提取细胞总RNA并按PrimeScript RT reagent Kit With gDNA
Eraser(Perfect Real Time)的说明进行逆转录反应,cDNA于-20 ℃保存。
1.2.8 实时定量PCR检测基因转染效率及BSP、DSPP、DMP1、OCN mRNA的表达 实验引物由大连宝生物公司设计合成(表1)。SYBR Green Ⅰ实时定量
PCR反应体系包括:cDNA 1 μL、正向和反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL、SYBR Premix Ex Taq 10 μL、去离子水7.4 μL,总体积20 μL。扩增条件:95 ℃
30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共45个循环。
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