活化Notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化的体外研究(2)
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参见附件。
1.6 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid pho-
sphatase,TRAP)染色
将在高糖或等渗甘露醇培养条件下受RANKL诱导的破骨前体细胞、ICN2-OE及EMPTY,用PBS洗2次,4%甲醛固定液室温固定10 min,PBS洗2次,甲醇和丙酮混合液(体积比1∶1)固定3~5 min,PBS洗2次,37 ℃条件下用TRAP染色液染色10 min,双蒸水洗3次,光镜观察并计数破骨细胞。多核(细胞核数目≥3个)且TRAP染色阳性的细胞视为破骨细胞。
TRAP染色液配方:N,N-二甲基甲酰胺500 μL、磷酸萘酚5 mg、TRAP缓冲液50 mL、固红紫色LB磷酸盐30 mg;其中TRAP缓冲液配制方法为:醋酸1 mL、三水合乙酸钠6.8 g、酒石酸钠二水11.5 g,加双蒸水溶解至1 000 mL。
1.7 RNA的提取、cDNA制备及实时定量PCR分析
将高糖或等渗甘露醇培养条件下,受RANKL诱导的破骨前体细胞,用TRIzol试剂一步法抽提细胞总RNA,紫外分光光度计测定RNA260 nm/RNA280 nm吸光度值以检测RNA样品的纯度和浓度;然后按FERMEN-TAS逆转录试剂盒标明的操作步骤进行实时定量PCR,cDNA合成在42 ℃进行60 min,70 ℃灭活5 min。用SYBR GREEN试剂盒进行实时定量PCR分析。利用Primer Express 2.0设计针对Notch2基因与内参照β-
actin的引物如下:小鼠Notch2正义链5’-CCCCTTGC-CCTCTATGTACCA-3’ ......
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