内皮细胞型一氧化氮合成酶Glu298Asp基因多态性与牙周炎伴Ⅱ型糖尿病的相关性研究(2)
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参见附件。
振荡混匀,55 ℃水浴3 h,煮沸8 min,-20 ℃保存。
1.2.2 eNOS Glu298Asp多态性目的基因的扩增和酶切 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测eNOS Glu298Asp的基因多态性。
引物(大连宝生物工程有限公司)序列为:上游引物5’-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3’,下游引物5’-CCCAGTCAATCCTTTGGTGCTCA-3’。PCR反应体系(25 μL):DNA模板6 μL,2×Taq PCR Master-Mix 12.5 μL,上下游引物各1.25 μL,dd H2O 4 μL。吹打后轻弹管壁混匀,1 000 r·min-1瞬时离心。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)循环参数:94 ℃变性5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析证实PCR扩增成功,取纯化后的PCR产物,限制性内切酶Ban Ⅱ(成都宝信生物技术有限公司,目录号N1215006)酶切,恒温水浴箱37 ℃水浴过夜。酶切片段经2.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后通过UV凝胶成像系统判定结果。
1.3 PCR质量控制措施
在盲法下测定所有标本 ......
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