高迁移率族蛋白1在慢性牙周炎病变牙龈组织中的表达(2)
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洗后加入德克萨斯红耦联的羊抗兔IgG(1∶200)常温
孵育1 h，冲洗后封片，使用含有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的封片液以显示细胞核，荧光显微镜下观察。切取的牙龈组织以4%甲醛溶液常温固定1 h后以石蜡包埋。部分牙龈组织进行常规苏木精-伊红(hematine-eosin，HE)染色；部分牙龈组织经脱蜡和乙醇梯度脱水后，以0.1 mol·L-1 C6H10O8和0.2 mol·L-1 Na2HPO4·2H2O进行抗原修复。抗原修复后行常规免疫组织化学染色。以含2%胎牛血清白蛋白的缓冲液阻断非特异反应，然后加入抗HMGB1抗体(1∶50)4 ℃下孵育过夜，反复冲洗后加入德克萨斯红耦联的羊抗兔IgG(1∶200)常温孵育1 h，反复冲洗后封片。共聚焦显微镜下观察。
1.5 ELISA
人PBMC加入10 μg·mL-1的LPS，以未加入LPS的细胞作为对照。静置48 h后，检测上清液中HMGB1的表达。分别以50 ng·mL-1 TNF-α和100 ng·mL-1 HMGB1刺激PBMC，48 h后检测上清液中HMGB1和TNF-α的水平。按照HMGB1和TNF-α ELISA试剂盒说明要求进行检测。在试验组患者进行牙周手术前，选择术区牙周探诊深度最深的2颗患牙，每颗牙选择4个
位点(颊舌侧近中和远中)以自制滤纸条收集患者的龈沟液。合并每颗牙同侧2个位点的龈沟液样本，稀释后按照HMGB1 ELISA试剂盒说明检测龈沟液中HMGB1的含量 ......
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