格列美脲对高糖环境下大鼠下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取的影响(2)
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1.2.2 实验分组 将成骨细胞以每毫升1×105个接种于35 mm平皿中(n=6)，每孔加液量为2 mL，细胞生长至融合后，无血清培养基孵育24 h，分别予以5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖处理细胞，持续24 h，加入10 ?mol·L-1 格列美脲干预120 min，然后进行葡萄糖摄取实验。实验分组：5.5 mmol·L-1组(生理浓度葡萄糖，对照组)、5.5 mmol·L-1+格列美脲组、16.5 mmol·L-1组(高浓度葡萄糖)、16.5 mmol·L-1+格列美脲组。
1.2.3 葡萄糖摄取的测定 培养结束后，弃去培养基，用温PBS清洗3遍，每孔加入1 mL含7.5 μCi·mL-1 18F-FDG的PBS，37 ℃孵育30 min，用预冷的PBS冲洗6遍，加入1 mL PBS刮取细胞，收集细胞悬液，用共形γ计数器测定总放射性计数。用总放射性计数与蛋白质浓度的比值，反应细胞葡萄糖摄取能力。
1.2.4 GLUT-1和GLUT-3免疫细胞化学染色 将第4代成骨细胞接种在盖玻片上，培养7 d后用95%乙醇固定，PBS洗涤，加兔抗大鼠GLUT-1、3(1︰100)，保湿，4 ℃过夜；PBS洗涤，加生物素化羊抗兔二抗，PBS洗涤；DAB显色，苏木素复染，封片。
1.2.5 Western blot检测GLUT-1、3的表达 将成骨细胞以每毫升1×105个接种于25 cm2培养瓶中，细胞生长至融合后，无血清培养基孵育24 h，分别予以5.5、16.5 mmol·L-1葡萄糖处理细胞，持续24 h，然后加入10 ?mol·L-1格列美脲干预120 min，实验分组同葡萄糖摄取测定实验，Western blot实验用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sul-fate-polyacrylamide gel electrophoresis ......
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