人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定(3)
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参见附件。
1.7 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。所有的细胞实验均重复3次，定量实验结果以均数±标准差来表示，组间两两单因素方差分析(one-way)比较采用ANOVA检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1的鉴定
重组载体经KpnⅠ及EcoRⅠ双酶切后，阳性克隆条带大小为395 bp，阴性克隆条带大小为330 bp(图1)。鉴定结果与预期相符，说明目的片段已正确插入pLenOR-THM慢病毒载体。
1、13为DL2000 Marker；2~4为shRNA1的3个克隆，均为阳性克隆；5~7为shRNA2的3个克隆，其中5、7为阳性克隆；9~12为shRNA3的4个克隆，其中9、10为阳性克隆；8为阴性对照。
图1重组载体经Kpn Ⅰ及EcoR Ⅰ双酶切鉴定结果
Fig1Validation results of recombinant vector by Kpn Ⅰ and EcoR
Ⅰdouble-digestion
DNA测序结果显示，构建的3个慢病毒载体均含有所设计的目的片段，其序列与设计的靶向Notch-1寡核苷酸序列完全一致，进一步证实目的片段已正确插入pLenOR-THM慢病毒载体，重组慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1构建成功(图2)。
2.2 慢病毒包装与病毒滴度测定
慢病毒载体四质粒共转染293T细胞48 h后，荧光显微镜下可观察到293T细胞发出大量绿色荧光。不同数量慢病毒感染293T细胞48 h后，其发出的绿色荧光强度不同(图3) ......
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