人Notch-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定(1)

http://www.100md.com 2014年3月1日 张庆庆 张森林 朱迎兰 董震 曹罡 陈伟

第4页

第1页

    参见附件。

     [文章编号] 1000-1182(2014)03-0267-06

    [摘要] 目的 构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体，寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法 针对人Notch-1基因序列，按照RNAi序列设计原则，设计3段RNAi靶点序列(shRNA1~3)，通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM，构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌，筛选阳性克隆，经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞，进行慢病毒包装并测定病毒滴度，观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后，运用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1，四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光；浓缩后的病毒滴度为

    5.8×108 TU·mL-1；以复感染系数为1时感染293T细胞，感染效率在90%以上。QRT-PCR和Western blot检测结果表明，pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高 ......

    http://www.100md.com/html/paper/1000-1182/2014/03/14.htm

您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件。