ＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料ｒｅａｌ—ｈｍｅＲＴ—ＰＣＲ检测ＲｂＡｐ46基因表达条件的优化
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摘要：目的 通过优化反应体系，建立SYBR Green I染料reaLtime RT-PCR检测RbAp46基因表达的方法。方法 构建pUCm-Tvector-RbAp46阳性模板，根据分子量及阿佛加德罗常数(6.023×1023分子数/mo1)换算为分子拷贝数，10倍倍比稀释后做标准曲线。根据标准曲线的斜率、相关系数、荧光强度及熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件。结果 25 μl的反应体系中10×PCR缓冲液2.5Pl，25 mmol/L MgClz 2.2 μl，10 mmol/LdNTPs0.5μl，20×SYBRGreenl 0.5μl，12.5Hmol/L引物各0 5μl，5U/μTaqDNA聚合酶0.3μl，cDNAlμl(相当于50 nsRNA)，双蒸水17P1。反应条件为：94℃5 mill预变性，96℃20s变性，58℃30s退火，72℃45 s延伸，40个循环，80℃时采集荧光信号，可以获得最好的扩增效率。结论 优化后的SYBRGreen l real-tmmPCR适合于检测RbAp46基因表达，具有比较好的重复性，灵敏度高，特异性强。
关键词：实时定量RT—PCR；SYBRGreen I染料；RbAp46基因
中图分类号：R733.702 文献标识码：A 文章编号：1673—0399(2005)02-0213—04
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