2.3 大鼠软骨下骨组织中VEGF、BMP2、Smad1 的mRNA和miR-20b表达水平检测

    采用逆转录(RT)-PCR法进行检测。取“2.2”项下部分冻存膝关节组织，采用Trizol试剂分别提取软骨下骨总RNA和mRNA，采用反转录试剂盒制得cDNA第一链，然后行RT-PCR扩增，引物序列见表1，扩增条件见表2。采用2-ΔΔCt法[13]，以GAPDH为内参计算VEGF、BMP2、Smad1的mRNA表达水平，以U6为内参计算miR-20b的表达水平。

    2.4 大鼠软骨下骨组织中VEGF、BMP2、Smad1的蛋白表达水平检测

    采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下部分冻存膝关节组织，采用全蛋白提取液(RIPA裂解液-蛋白酶抑制剂混合物-蛋白磷酸酶抑制剂混合物-PMSF的体积比为100 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1)提取软骨下骨全蛋白，采用Bradford比色法测定蛋白浓度。离心收集软骨下骨全蛋白，加入SDS蛋白上样缓冲液×5次，95 ℃孵育5 min，在-20 ℃条件下保存备用。分别采用浓缩胶和分离胶进行蛋白电泳 ......