杨华蕊，杨永寿，肖培云(1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000)

    美洲大蠊(Periplaneta americana L.)作为我国传统药用昆虫，其性寒，味咸，归肝、脾、肾经，古人称之为“蜚蠊”，是地球上起源最早、生命力最顽强的昆虫类群之一[1]。现代研究表明，美洲大蠊中含有蛋白质、氨基酸、多糖、核苷、甾体和萜类等多种活性物质[2-3]，具有抗肿瘤、保肝、促进组织修复、增强机体免疫力、抗氧化等药理作用[4-6]。多项研究证实，美洲大蠊提取物可不同程度地抑制肝纤维化相关因子的含量，改善肝功能，从而抑制肝纤维化的进展[7-8]。本课题组一直致力于美洲大蠊的开发研究，前期研究已优化获得美洲大蠊脱脂膏提取工艺，并拟进一步对脱脂膏进行分离纯化以获得抗肝纤维化活性部位。然而，美洲大蠊脱脂膏提取率虽然较高(可达14.06%)，但其抗肝纤维化活性部位提取率却偏低(仅0.54%)[9]，不利于后期的开发利用。

    自20世纪以来，酶化学与多学科的交叉研究得到了迅速发展和应用，特别是在医药和食品领域发挥了巨大作用[10]。酶解技术被常用于动物类药材的提取。动物类药材的物质基础多为小分子肽类，在提取过程中引入酶解技术，可将蛋白质、多肽等大分子物质酶解为能被更好地吸收入血的小肽类物质，有利于提高动物类药材活性成分的提取效率并改善其药理活性[11-14]。由于不同的蛋白酶具有不同的专一性和切割位点，所得到的酶解产物中肽类物质的氨基酸序列也各异[15]，因此本研究通过对5种常用蛋白酶进行考察，拟筛选出最适于美洲大蠊中抗肝纤维化活性部位酶解制备工艺的水解蛋白酶，为后续酶解制备抗肝纤维化活性部位提供工艺基础。

    1 材料

    1.1 仪器

    AL204-IC型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；SN255939型多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；5510E型CO2恒温培养箱(美国NuAire公司)；SK5200H型超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；4500A型多功能粉碎机(永康市艾泽拉电器有限公司)；TU1901型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

    1.2 试剂

    胰蛋白酶(TR，250 U/mg)、胃蛋白酶(PE，250 U/mg)、碱性蛋白酶(AL，200 U/mg)、木瓜蛋白酶(PA，6 000 U/mg)、中性蛋白酶(NE，200 000 U/mg)、pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自北京索莱宝科技有限公司；酪氨酸对照品、小牛血清白蛋白对照品(中国食品药品检定研究院 ......